甲状腺激素调控牙鲆变态发育中关键microRNAs的筛选及功能鉴定

Japanese flounder is a model organism to study the post- embryonic metamorphic development. The microRNA (miRNA) is a type of small no-coding RNAs molecule, and plays a key role in the animal development by controlling post-transcriptional level of the target genes. It is still unknown which miRNAs is involved in the metamorphic regulation of the 197 Japanese flounder miRNAs already identified. Hence, in this project, we will firstly screen out differential expression miRNAs among the normal, thyroid hormone (TH) induced and thiourea (TU) inhibited metamorphic larvae using Illumina next generation high-throughput DNA sequencing. Secondly, miRNAs target genes will be verified, and the spatial and temporal expression profile of these miRNAs and target genes be constructed during early development, and then identify miRNAs associated with larval metamorphosis (eyes shift, Coronary young fin ebb and flow, pigmentation, and heterauxesis, etc). Finally, we will conclude using miRNA overexpression (agomir) and inhibition (antagomir) to analyze the biological function of the 2-4 selected miRNAs during the metamorphosis of larvae, and also their biological mechanism in the Japanese flounder cell. The fulfillment of this project will help us to understand miRNAs molecular regulation mechanism in the TH-induced larval metamorphosis, and provide a theoretical basis and basic data for the study of Japanese flounder metamorphosis and the exploitation and utilization of the marine biological resources.

牙鲆变态是研究脊椎动物胚后发育的重要模型。microRNA（miRNA）是一类重要的非编码小RNA，通过对靶基因的转录后抑制调控动物的发育。在已发现的197个牙鲆miRNAs中，究竟哪些miRNAs对变态起调控作用，尚不清楚。为此，本项目首先用高通量测序在正常、甲状腺激素（thyroid hormone，TH）诱导和硫脲（thiourea，TU）抑制变态仔鱼中筛选显著差异表达的miRNAs；然后预测并验证miRNAs的靶基因，分析它们的时空表达谱，确定变态（如眼睛移位、冠状幼鳍消长、色素沉积和不对称生长等）相关的miRNAs；最后用miRNAs过表达（agomir）和抑制（antagomir）等，阐明2-4个关键miRNAs在仔鱼变态和牙鲆细胞中的生物学功能。本项目的顺利完成，有助于了解miRNAs在牙鲆变态发育中的分子调控机制，为牙鲆变态机制的研究和海洋生物资源的开发利用提供资料积累。

牙鲆变态是研究脊椎动物胚后发育的重要模型，牙鲆变态机制的揭示对探索动物不对称发育具有重要的意义。microRNA（miRNA）是一类重要的非编码小RNA，其在动植物基因转录后调控中发挥着重要的作用。之前，本实验室已经鉴定了100多个牙鲆变态过程中表达的miRNAs，但它们在变态中的作用目前尚不清楚。并且已研究证实：甲状腺激素（TH）能加速仔鱼的变态，而硫脲（TU）则抑制其变态。因此本研究中我们首先通过Illumina高通量测序的方法，从正常组，TH促进组和TU抑制组仔鱼中筛选出差异表达的miRNAs，挑选出关键的miRNAs（异时性let-7 miRNAs、眼睛发育相关miRNAs等）并分析它们的表达模式；然后生物信息预测验证它们的靶基因，构建miRNAs-靶基因的调控关系，并分析这些靶基因的表达模式；最后在仔鱼体内或细胞内分析这些miRNAs及其靶基因的生物学功能。研究结果表明：有多个受TH和TU调控差异表达显著的miRNAs被鉴定，并且获得了多个候选靶基因；异时性let-7 miRNAs能够靶向调控lin-28a基因，同时lin-28基因反馈调控let-7 miRNAs的剪切成熟，构成了let-7/lin-28负反馈信号网络，并在细胞增殖调控发挥重要作用；鉴定了与眼睛发育相关的miRNAs（miR-96、miR-124、miR-182、miR-183），实验证实外源性TH或TU对它们的表达水平在变态过程中有显著的影响，感光系统的5个视蛋白在变态高分期和眼睛组织中显著高表达，并且RH、red、blue opsin（视蛋白）基因的表达水平被外源性TH显著上调，并实验证实blue opsin是miR-124和miR-182的靶基因，otx2（视锥、视杆细胞发育相关转录因子）基因是miR-124的靶基因，同时通过启动子双荧光报告实验，我们初步认为blue opsin基因可能是甲状腺激素受体（TR）直接调控的靶基因，并且该基因可能在牙鲆变态期间由浮游向底栖过渡中发挥着重要的作用。目前为止，该项目研究已基本完成，但在miRNAs体内干扰试验中仍然存在问题，今后我们会继续努力争取在该方面尽快突破，从而在体内进行miRNAs功能研究。总之，该研究的顺利完成，不仅能解析TH、miRNAs和牙鲆仔鱼变态三者之间的调控关系，而且对揭示牙鲆变态的分子机制提供重要的理论基础。