CrCDPK1调控莱茵衣藻三酰甘油生物合成的分子机制研究

The potential breakthrough to overcome the major bottleneck for producing microalgal biodiesel is to create new germplasm combined high oil content with high biomass by using genetic engineering strategies. Therefore, it is of great theoretical and practical significance to reveal the molecular regulatory mechanism of triacylglycerol (TAG) biosynthesis in microalgae. The previous results showed that calcium (Ca2+) signal transduction played a crucial role in TAG synthesis in Chlamydomons reinhardtii, and the content of TAG was significantly decreased after CrCDPK1 gene silencing under nitrgoen deficiency condition. In this study, the role of CrCDPK1 in TAG synthesis is further confirmed by the gene silencing and overexpression in C. reinhardtii. The proteins interacted with CrCDPK1 are screened and phosphorylation of CrCDPK1 are examined. Furthermore, to analyze the differential gene expression profiles and lipid metabolic profiles, RNA-seq and LC-MS/MS are performed in a double mutant of cdpk1 and the target gene, aiming at revealing the molecular mechanism of CrCDPK1 involved in TAG synthesis in C. reinhardtii.

利用基因工程的方法创建产油微藻新种质，是克服微藻生物柴油产业化瓶颈的潜在突破口，而解析三酰甘油生物合成的分子机制是其重要前提。前期研究发现，钙信号是莱茵衣藻三酰甘油生物合成的关键调控因子，钙依赖蛋白激酶1（CrCDPK1）在其中发挥重要作用。在此基础上，本项目将进一步验证CrCDPK1基因对三酰甘油生物合成的调控作用，通过对CrCDPK1互作蛋白的分离鉴定，及其与靶蛋白的磷酸化作用位点研究，揭示钙信号如何通过CrCDPK1的激酶活性高效传递，并引起三酰甘油在细胞中合成和累积的分子调控机制。构建CrCDPK1和靶基因的双突变体，比较突变体和野生型在转录组及脂代谢组上的差异变化，分析CrCDPK1--靶蛋白的信号通路与全基因组基因表达模式及各脂质代谢途径之间的关系，全面阐释CrCDPK1基因调控三酰甘油生物合成的分子机制。

微藻三酰甘油（TAG）被认为是最具潜力的生物柴油原料之一。氮缺乏条件下微藻大量积累TAG，而其分子调控机制还知之甚少。本研究从15个莱茵衣藻钙依赖蛋白激酶（CrCDPK）家族成员中，筛选到CrCDPK1基因RNAi沉默表达后，转基因藻株的油脂含量显著降低。随后克隆了CrCDPK1的全长基因，并构建了过量表达载体，转化莱茵衣藻CC425。RNAi和过量表达重组载体的转化率分别为95.5%和41.7%。RNAi基因沉默效率可达72%以上，过量表达转基因藻株中，CrCDPK1基因mRNA水平也极显著高于对照，约为对照的7倍以上。分别对RNAi基因沉默和过量表达转基因藻株的细胞密度、油脂含量、淀粉含量和叶绿素含量进行了测定，结果表明，RNAi 转基因藻株的油脂含量均显著下降，而淀粉含量则显著升高；过量表达转基因藻株则与之相反，油脂含量均显著升高，淀粉含量显著下降。另一方面，基因过量表达的转基因藻株中，细胞密度和叶绿素含量均显著低于对照。而RNAi转基因藻株中叶绿素含量并未受到影响。转基因藻株中细胞密度和叶绿素含量则未受到显著影响。RNA高通量测序结果显示，CrCDPK1基因RNAi沉默表达和过量表达后，千余基因的表达受到影响，并且缺氮30min诱导差异表达基因的数量为缺氮24h的2.5倍左右。通过比较各代谢通路的变化，发现CrCDPK1基因沉默后上调、而过量表达后下调的代谢通路主要集中在脂质代谢、淀粉和蔗糖代谢、能量代谢和氨基酸代谢等过程，而CrCDPK1基因沉默表达后下调，而过量表达后上调的通路主要集中在遗传信息的处理过程，包括RNA转录、蛋白质翻译、折叠分类及降解和复制与修复的各个方面。缺氮24h后差异表达基因参与的代谢通路与缺氮30min类似。表明CrCDPK1基因位于缺氮诱导油脂积累调控网络的上游。通过调控遗传信息的处理过程，进而影响下游的各个代谢通路，促进碳源在氮缺乏时更多地流向脂质合成途径。这为研究微藻油脂合成与代谢提供了新的研究思路，为进一步利用基因工程的方法创建产油微藻新种质奠定了基础。