莱茵衣藻缺氮诱导三酰甘油积累缺陷突变体筛选及功能分析

当前，全球范围掀起一股新能源研究热潮。高含油量的微藻极有可能替代目前用于生物柴油炼制的农产品，成为未来能源的主要来源。缺氮诱导微藻油脂积累早在1949年就有研究报道，但其内在机理迄今为止尚不清楚。相对于在动物和植物油脂合成代谢领域所取得的成就，微藻产油机理的研究尚处于起步阶段。本项目以莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）为研究对象，通过筛选和分析三酰甘油积累缺陷突变体，研究调控细胞缺氮与三酰甘油积累相关的基因，以及调控三酰甘油合成和降解的调控基因，和上游缺氮信号传递过程中所影响的与三酰甘油积累相关的基因。初步阐明缺氮诱导油脂合成机理。其研究结果不仅丰富了油脂合成与代谢领域的基础知识，同时为产油藻的遗传改良和产业化打下基础。

本项目通过对莱茵衣藻油脂积累突变体库建立和功能研究，利用插入突变获得插入阳性转基因藻株18531个，鉴定出高油转基因藻株276个，低油转基因藻株352个，最终获得有效突变体16个。对突变体Mu726对应的B-box锌指结构蛋白Cr-Bbox（159133）基因和Mu126对应的Ring型E3泛素连接酶Cr-RING（332358）基因进行深入研究。.Cr-Bbox基因为突变体Mu726插入部位影响的B-box锌指结构蛋白基因，该基因位于13号染色体4704896-4790782位置，该基因被突变后，莱茵衣藻油脂含量升高；突变体Mu126插入部位影响一个Ring型E3泛素连接酶活性基因，该基因位于16号染色体3010088-3013923位置，当此基因受到影响时，细胞中显著积累油脂。通过RNAi干涉的方法构建载体，并转化野生型莱茵衣藻验证基因功能。结果显示，Cr-Bbox基因干涉转基因藻株，藻细胞中的油脂含量升高了10-31.28%，生物量下降；Cr-RING基因干涉转基因藻株，油脂含量升高了10%-17%，生物量也下降。说明这2个基因对油脂积累是反向调控的。进一步实验显示，Cr-Bbox基因敲除后，DGAT2、PAP2、PDAT3和PFK等在三酰甘油的合成和糖酵解中起着重要的正调控作用的基因mRNA丰度显著升高，而CIS、FBP和PEPC1参与三羧酸循环和糖异生抑制碳流流向油脂合成的基因mRNA丰度下降。Cr-RING基因敲除后， DGAT2、PAP2、PDAT3和PFK 上调表达，CIS、FBP和PEPC1下调表达。通过酵母双杂交寻找与Cr-Bbox和Cr-RING基因作用的蛋白，经过四轮筛选，得到阳性克隆18个。其中，与Cr-Bbox相互作用的蛋白10个，与Cr-RING相互作用的蛋白6个，双分子荧光检测蛋白相互作用及蛋白的进一步研究有待后续课题支持进行。同时，利用基金支持，对油脂合成关键酶如DGAT，PEPC，以及微藻生理、生物学基础进行研究。.在国内外期刊上共发表论文18篇，其中SCI源期刊论文8篇，国内核心期刊7篇，其它期刊3篇；申报国家发明专利5项，授权2项，培养硕士研究生4名。