铁调控枢纽Hepcidin-Fpn1在动脉粥样硬化进程中的作用及其机制研究

The role of iron misregulation in the development of atherosclerosis process is getting more and more attention.Previous studies revealed that the levels of iron and ferritin were significantly elevated in the macrophages within the atherosclerotic plaque. Our preliminary results revealed not only the abnormal expression and localization of Fpn1, but also the intensive Prussian blue staining in the patients' atherosclerotic plaques, which indicated the accumulation of iron. In this project, we will investigate how iron misregulation in macrophage affects the formation of foam cells and lipid deposition, and further to accelerate the development of atherosclerosis progress through hepcidin-ferroportin axis. Double deficienct mice of Fpn1 (Fpn1-/-, a conditional knockout mice in macrophage) and ApoE (ApoE-/-, an atherosclerosis model mice) are to be generated. Drugs LDN (a reagent inhibiting the synthesis of hepcidin) and DFO (Deferoxamine, an iron chelator) are subject to disturb iron metabolism. Characterization of the double mutant mice is to be carried out to evaluate the severity of atherosclerosis after drug treatment via technologies of biochemistry, immunohistochemistry, and molecular biology. Meanwhile, cell culture model of atherosclerosis is to be used with human/murine macrophages with addition of oxidized low-density lipoprotein (oxLDL). Iron and lipid content of macrophages and formation of foam cells are to be measured after the manipulation of iron metabolism by addition of LDN, DFO， and hepcidin. This study is expected to further elucidate the role of iron metabolism of macrophage in the pathogenesis and development of atherosclerosis. The findings will provide new ideas and targets for clinical prevention from atherosclerotic disease .

铁代谢紊乱在动脉粥样硬化发展进程中的作用越来越受到关注。研究发现在动脉粥样斑块处巨噬细胞内的铁和铁蛋白的含量显著升高。我们的前期研究发现，在病人的粥样斑块中Fpn1表达异常，普鲁士蓝染色显示铁的积聚。本课题拟通过hepcidin-ferroportin途径调控巨噬细胞内的铁，研究铁代谢异常如何影响泡沫细胞的形成和脂质沉积，从而影响动脉粥样硬化的发展进程。本实验以巨噬细胞Fpn1基因条件敲除小鼠及ApoE-/-小鼠为对象，利用LDN和DFO来干扰铁代谢，检测动脉粥样硬化斑块发展进程；在细胞水平，利用人源、鼠源巨噬细胞，并用LDN、hepcidin和DFO处理来调节铁代谢，定性观察定量检测加入oxLDL后巨噬细胞内铁和脂质含量变化及泡沫细胞形成情况。以上研究结果有望进一步阐明粥样斑块处巨噬细胞内铁的累积在动脉粥样硬化发展进程的作用，为动脉粥样硬化疾病的临床防止提供新的思路及靶点。

铁代谢紊乱在动脉粥样硬化发展进程中的作用越来越受到关注,国内外研究发现在动脉粥样斑块处巨噬细胞内的铁和铁蛋白的含量显著升高。临床样本方面，我们检测了人体内动脉斑块处巨噬细胞铁代谢的相关指标。发现人体内动脉粥样硬化（AS）斑块处的铁蛋白含量显著高于正常血管，提示斑块处确实存在明显的铁沉积。通过进一步检测病人斑块处铁代谢相关蛋白，我们发现巨噬细胞中的亚铁氧化酶会在细胞中出现大量脂质积累的情况下出现表达异常，并导致细胞中的铁积累加重，进一步通过对RAW264.7细胞进行相似的研究，得到了与临床斑块检测一致的结果。动物实验方面，通过ApoE-/-小鼠与巨噬细胞条件敲除Fpn1-/-小鼠杂交，我们获得双基因敲除小鼠ApoE-/-FPN1-/-。研究发现，相较ApoE-/-小鼠，ApoE-/-FPN1-/-小鼠肝脏、脾脏和血管组织中的铁含量明显上升，巨噬细胞内铁累积加重。进一步我们对两种基因型小鼠动脉粥样硬化进行研究，发现ApoE-/-FPN1-/-小鼠主动脉油红染色阳性区域显著多于ApoE-/-小鼠。对动脉粥样硬化斑块进行稳定性研究发现，ApoE-/-FPN1-/-小鼠斑块处组分发生变化，表现为胶原减少，巨噬细胞增加，平滑肌细胞减少，提示斑块不稳定性提高。血清指标检测发现，ApoE-/-Fpn1-/-小鼠与ApoE-/-小鼠血清甘油三酯、总胆固醇、血清铁调素和白介素6无显著差异。我们在使用铁螯合剂DFP后，发现DFP能显著改善ApoE-/-Fpn1-/-小鼠动脉粥样硬化，提高斑块稳定性。细胞水平的研究发现， ApoE-/-Fpn1-/-小鼠腹腔巨噬细胞油红染色加深，Western Blot结果显示ABCA1/ABCG1蛋白表达下降，CD36表达上升，表明巨噬细胞铁累积造成脂质吞噬能力增强，外排脂质能力下降，从而促进了泡沫细胞形成。以上实验结果说明，ApoE-/-Fpn1-/-小鼠动脉粥样硬化显著加重，通过铁螯合剂的应用能减轻动脉粥样硬化的发展。国际上目前对于动脉粥样硬化的治疗多集中降低血脂特别是低密度脂蛋白，而对于增加巨噬细胞脂质的释放则较少，本实验结果能为临床上通过调节铁代谢治疗或干预动脉粥样硬化提供重要理论依据。相关细胞和动物实验结果已经发表SCI论文6篇，撰写SCI论文2篇。