加工条件下橡胶籽内源β-葡萄糖苷酶原位稳定模式研究

The high-content cyanide is one of the critic limiting fators to make full use of the large amount of Hevea brasiliensis seed. In according to earlier study on hevea brasiliensis seed, the cyanogenic glycosides degrades quickly during proper storage after harvest and high-activity β-glucosidase was found in Hevea brasiliensis seed, with high tolerance in situ against high temperature, which can tolerate even 90℃ for 20h with activity remaining of 80%. In this project the study be conducted to find out the stability trend and mechanism of endogenous β-glucosidase in Hevea brasiliensis seed under processing conditions. The methods for cyanogenic glucosides and total cyanide determination be confirmed, the effect of processing conditions on stability of endogenous β-glucosidase in whole Hevea brasiliensis seed, the seed kernel powder and extraction solution, so as to the total cyanide content and linamarin be traced during the whole processing period. Freeze-driedβ-glucosidase,pure and mixed with cell ingredients,be treated under processing conditions, after which the methods of native gel electrophoresis, gel chromatography, IR and NMR, be used to study the aggregation state, denature temperature and structure of samples after treatments of different degree. The effect of remaining β-glucosidase be assessed on cyanogenic glycosides elimination. This study be conducted to establish a new green methods for cyanogenic glycosides elimination by endogenous β-glucosidase in Hevea brasiliensis seed. The result of the study will promote the utilization of Hevea brasiliensis seed, and also be a good example for other material containing cyanogenic glucoside.

橡胶籽是一种含氰量极高的资源，资源量大但利用受限。申请人在前期研究中发现采后橡胶籽有极强的氰苷自发降解能力，其内源β-葡萄糖苷酶活力极高，原位热稳定性好，可耐长时间高温处理。本项目拟在此基础上进一步研究加工条件下橡胶籽内源β-葡萄糖苷酶的稳定性规律及机制。主要开展亚麻苦苷及总氰检测方法研究，加工条件对橡胶籽籽粒状态、粉碎状态、溶液状态下内源β-葡萄糖苷酶酶活及总氰变化规律的影响，将酶与多种细胞成分混合模拟其原位状态，通过非变性电泳、凝胶色谱、差示量热仪、红外光谱、核磁共振等手段研究橡胶籽β-葡萄糖苷酶在不同状态下经处理后的聚合状态、热变性温度、空间结构，通过对比研究其原位状态下的稳定机制，最后评估经加工材料中残留β-葡萄糖苷酶在氰苷脱除中的应用效能。本研究的目的在于探索一种充分利用橡胶籽内源β-葡萄糖苷酶进行脱氰的绿色加工新方法，促进热区橡胶籽资源利用，并对其他含氰资源利用有借鉴意义。

前期研究发现橡胶籽含有丰富的内源β-葡萄糖苷酶，且具有相当好的原位耐高温能力。本课题主要研究了橡胶籽内源β-葡萄糖苷酶在加工条件下的原位稳定模式，以探索在经历相应加工后橡胶籽内源β-葡萄糖苷酶在后续脱毒和营养、风味改善方面可能的应用。. 将未经炒料处理的橡胶籽材料高压处理，结果表明水份和油脂的存在对橡胶籽内源β-葡萄糖苷酶在高压下的稳定具有重要作用，且呈负相关趋势；进一步研究发现橡胶籽水分含量对橡胶籽内源β-葡萄糖苷酶耐高温能力具有负相关趋势，其稳定性跃变温度范围在100－115℃之间。模拟工业榨油的先炒料再压榨工艺，跟踪内源β-葡萄糖苷酶活性变化规律；结果发现，橡胶籽内源β-葡萄糖苷酶在低水分含量状态下经受炒料115－120℃高温1h后进行压榨，其酶活保留仍达70%以上，表明经普通榨油工艺加工后橡胶籽饼中仍具有相当高活力的β-葡萄糖苷酶，为橡胶籽饼后续利用β-葡萄糖苷酶来脱除氰毒、改善营养和风味提供了可能。. 在溶液状态下研究糖、多元醇、蛋白、脂、无机盐对橡胶籽β-葡萄糖苷酶活性影响，结果表明糖、多元醇、蛋白均对溶液状态下的橡胶籽β-葡萄糖苷酶温度稳定性有积极贡献，磷脂对橡胶籽β-葡萄糖苷酶温度稳定性无显著影响，受试无机盐对橡胶籽β-葡萄糖苷酶温度稳定性有负面作用。将酶与糖、多元醇、蛋白、脂类、盐类等物质共混、冻干后经高温、高压处理，发现糖、多元醇、蛋白能不同程度地提高酶的高温稳定性。DSC数据显示受试糖/酶共混物相变温度和相变热焓较酶蛋白有显著提高，表明糖的存在有利于维持酶结构的高温稳定性，使发生完全变性时需要的能量更高。推测在低水分条件下，用于维持酶蛋白分子空间结构的疏水作用得到强化；多羟基亲水物质的存在有助于减少自由水分子数量、帮助维持酶蛋白的疏水结构，从而提高其高温稳定性。. 在研究中改进了总氰测定国标(GB/T13084-2006)方法，建立了使用蒸发光检测器检测亚麻苦苷的液相色谱法，对相关农副产品、食品、饲料的安全性具有重要意义。.