水稻种子抗老化能力的基因-基因相互作用调控网络研究

In our previous study, from four types of transgenic (miR164c silent, miR164c over-expressing, miR168a silent and miR168a over-expressing) lines of rice Kasalath, sub-lines with ageing resistance/storage tolerance superior or inferior to wild type have been screened out. With these special germplasms, in this project, we will: (1) proceed transcriptome sequencing, degradome sequencing and proteome iTRAQ analysis of their seeds with different ageing resistance and explore differentially expressed proteins (genes) in them, (2) identify insertion loci/genes of exogenous genes in the receptor chromosome of all of these transgenic lines, and verify the effects of the changes of the transcription of insertion loci (genes) on the ageing resistance of seeds by means of manipulating over-expression or CRISPR/Cas gene-editing technique, (3) analyze the association between insertion loci (genes) and proteins with differential expression shown in omics detection, so as to mine the key genes regulating seed ageing resistance, (4) screen out and verify the key genes and their interacting proteins by means of yeast two-hybrid system and RT-PCR analysis. This project will uncover the gene-gene interaction network regulating seed ageing resistance and provide theoretical basis and technological means for improving seed storage quality through molecular breeding pathway in the future.

基于前期研究中，我们从水稻Kasalath的四类转基因(miR164c沉默、miR164c过表达、miR168a沉默、miR168a过表达)株系中皆筛选到了种子的抗老化能力或贮藏耐性优于野生型的株系和不如野生型的株系，本项目拟对这些特殊种质的种子进行老化前后的转录组、降解组和蛋白质组iTRAQ比较，分析差异表达蛋白(基因)与种子抗老化能力的相关性；鉴定转基因株系中外源基因在受体染色体上的插入位点/基因，通过过表达和CRISPR/Cas基因编辑技术检验插入位点/基因的表达变化对种子抗老化能力的影响，同时与基因蛋白组学分析显示的差异蛋白进行关联分析，挖掘调控种子抗老化能力的关键基因；通过酵母双杂系统、RT-PCR分析等筛选和验证与关键基因相互作用的蛋白质(基因)。以上研究将揭示水稻种子抗老化能力的基因-基因相互作用调控网络，并为下一步通过分子育种途径改良种子贮藏质量提供理论依据和技术手段。

水稻Kasalath及其miR164c的沉默(MIM164c)和过表达(OE164c)株系的种子活力存在差异，以之为材料，本项目研究结果表明：(1) Kasalath及其MIM164c和OE164c突变体种子的转录组、蛋白质组和降解组皆存在显著差异，通过GO、KEGG、MapMan分析以及转录组与蛋白质组的关联分析，筛选到显著富集的6大类(胁迫响应、内质网蛋白加工、胚发育、丝氨酸内肽酶抑制剂、能量代谢以及其他)功能基因/蛋白；运用MERLIN迭代算法和String分析表明，miR164c的靶基因OsPSK5和OsTIL1与一个泛素相关的枢纽基因OsRPS27AA进行互作，进而作用于上述6大类功能基因，形成调控水稻种子活力的基因/蛋白互作网络。(2)结合NCBI数据库中水稻在多个逆境胁迫下的基因表达数据，对Kasalath及其MIM164c和OE164c突变体种子的差异表达基因进行 MERLIN模块分析，找到了miR164c介导的多个与种子抗老化能力、水稻抗病害、干旱胁迫或盐胁迫等调控相关的模块，RPS27AA是这些模块中的关键调控因子。(3)对Kasalath及其MIM164c和OE164c突变体的老化前后种子胚进行降解组测序，共获得421个miRNAs的1247个靶转录本，突变体与野生型种子及其老化前后均存在miRNA靶转录本的组成和数量的差异；miR164c可能通过miRNAs-靶基因互作网络调节种子活力，其中，miR5075的部分靶基因可能是互作网络中的关键基因，其中，miR164c的靶基因OsMTN5 和OsTIL1分别与miR5075的靶基因OsNAC52 和Os02g0817500直接或间接互作。GO、KEGG分析以及酵母双杂试验表明，该miRNAs-靶基因互作网络与上述miR164c介导的基因/蛋白互作网络的结果相吻合。(4) miR168a及其靶基因可能通过调控种子中与蛋白质合成、呼吸代谢和抗氧化作用相关的基因和蛋白表达而调控种子活力或抗老化能力。以上结果为揭示种子活力的分子调控机制提供了新的观点和证据。