miR164c和miR168a对水稻种子活力的调控作用研究

The results of miRNA microarray analysis and Real time quantitative PCR (RTqPCR) validation of the former project (NSFC, No.31071487) indicated that with artificial aging treatment, the seed vigor of rice (Oryza sativa L.) gradually declined, in the meantime the expression of miR164c and miR168a of rice seeds showed regularly falling or rising respectively, suggesting that these two miRNAs may be involved in the regulation of rice seed vigor. Hereby applying for the present project: (1) to detect the expression of these two miRNAs with vigor forming(with seed development) and in the natural aging process of rice seed, verifying the relationship between the expression of miR164c and miR168a with the seed vigor of rice; (2) to construct the over-expression and silencing system vectors of these two miRNAs, then transform them into rice and obtain transgenic seeds, by comparison with wild-type (non-genetically modified receptor rice) seeds, to explore the effect of artifially manipulating the expression of these two miRNAs on rice seed vigor; (3) to study the molecular mechanism included in the function mode of miRNAs on their target genes, and then how to affect rice seed vigor. Through this project, from a new perspective, we may reveal the molecular mechanism regulating seed vigor by miRNAs, and set up the technique platform to improve the storage quility of rice seeds and other plant germplasm resources through the genetic manipulation of miRNA expression levels of seeds in the future.

前期的miRNA芯片分析和Real time PCR验证结果表明，人工老化处理的水稻种子中miR164c和miR168a的表达量随种子活力的下降分别呈现规律性的下降或上升变化，因此推测这两个miRNA可能参与水稻种子活力的调控。现申请本项目：（1）检测这两个miRNA的表达在水稻种子活力形成（种子发育过程）和自然老化过程中的变化规律，全面验证其与种子活力的关系；（2）构建这两个miRNA的过表达和沉默体系载体，转导水稻，获得转基因水稻种子，与野生型（非转基因受体水稻）种子相比较，探讨人工调控这两个miRNA的表达量变化对水稻种子活力的调控作用；（3）研究miRNA-靶基因-蛋白质表达-水稻种子活力之间的分子作用机制。通过本项目研究，可能从一个新的角度认识种子活力的分子调控机制，并为今后通过遗传操纵手段调控种子中miRNA的表达水平，改良水稻种子和其他植物种质资源的贮藏特性建立技术平台。

基于从miRNA生物学功能的角度认识种子活力的分子调控机制，并为通过遗传操纵手段调控种子中miRNA的表达水平，改良水稻种子和其他植物种质资源的贮藏特性而建立技术平台。本项目通过研究，（1）全面验证了 miR164c 和 miR168a 的表达在水稻种子活力形成（种子发育过程）和自然老化过程中的变化规律及其与种子活力的关系。结果表明，miR164c 下调或 miR168a 上调有利于种子活力的保持。（2）用 Gateway 方法和靶基因拟态技术，构建了 miR164c 和 miR168a 的过表达和沉默载体，转导水稻Kasalath，成功创制了① miR164c 沉默（MIM164c）、② miR164c 过表达（OE164c）、③ miR168a 沉默（MIM168a）和④ miR168a 过表达（OE168a）四个类型的转基因株系；并已筛选、加代繁殖至 T5 代。在转基因株系中，这两个 miRNA 的表达量变化确实能够调控水稻种子活力（与预期结果一致）。但同时从四大类型转基因株系中皆筛选到了种子抗老化能力与人工调控miRNA 表达量不符合的亚类型（与预期结果不一致），原因可能与外源 miRNA在这些非预期株系中的插入位点（基因）的功能和作用有关。四类转基因株系中种子抗老化能力存在差异的亚类型的获得，为进一步研究基因互作网络调控种子活力的分子机制提供了独特的种质资源。（3）初步研究了 miRNA-靶基因-蛋白质表达-水稻种子活力之间的相互关系。结果表明， miR164c 的靶基因（Os-PM27）和 miR168a 的靶基因（Os-PTR2和 Os-AGO1）的表达与预期一致。（4）以MIM164c和OE164c转基因株系种子为材料，进行了水稻种子活力差异的基因-蛋白组学关联分析，从蛋白整体水平上全面探讨了 miRNA-靶基因-蛋白质表达-水稻种子活力之间的关系。从转录组学和蛋白组学角度综合研究了调控水稻种子活力或抗老化能力的分子机制。