基于波拉霉素产生菌基因组挖掘的新抗真菌代谢产物研究

Crop production was threatened by the plant pathogenic fungi dramatically and the loss must be heavy whenever the eruption happened, all the facts above lead to the indubitable requirement for biological pesticides originated from natural sources with high efficiency and low toxicity. Microbial genome mining has become an important approach to discover new metabolites from microorganisms. Polaramycin is a new group of polyol macrolide antibiotics with high antifungal activity and owns independent intellectual property rights in China. In this study, the genome of the polaramycin producing bacteria, Streptomyces hygroscopicus LP93, will be sequenced and systematically analysed by bioinformatic approaches. Then the silent biosynthetic gene clusters will be activated to produce new metabolites by means of chemical induction, co-culture, genetic modification and heterologous expression. Subsequently, the novelty of secondary metabolites in the fermentation broth will be analysed using LC-MS and AntiBase microbial natural products database. Relying on the microbial drug screening platform in cooperation unit, metabolites with novel structure and new antifungal mechanism are expected to be obtained guided by “the screening model targeting the chitin synthase”, which will lay solid foundations for further studies of new biological pesticides or antifungal drugs.

植物病原真菌危害农作物的安全生产，造成巨大损失，对天然来源、高效低毒的生物农药要求日益迫切。微生物基因组挖掘逐渐成为微生物新代谢产物发现的重要途径。波拉霉素是高抗真菌活性的，具有我国自主知识产权的多羟基内酯类新抗生素。本项目以波拉霉素产生菌（吸水链霉菌LP3）为研究对象，在对其全基因组测序，并进行系统基因组生物信息学分析的基础上，利用化学诱导、共培养、遗传修饰、异源表达等技术，激活菌株的沉默生物合成基因簇，对菌株的次级代谢能力进行充分的挖掘研究，借助LC-MS、AntiBase微生物天然产物数据库等分析、排重技术手段，依托项目合作单位的微生物药物筛选平台，应用“靶向几丁质合成酶的筛选模型”跟踪活性，定向发现新颖结构、新作用机制的抗真菌化合物，为开发新型生物农药或抗真菌药物奠定基础。

植物病原真菌危害农作物的安全生产，造成巨大损失，对天然来源、高效低毒的生物农药要求日益迫切。另外，多重耐药菌株的出现, 也已对人类健康造成巨大威胁，急需具有新颖作用机制的新抗生素的发现。随着基因组测序技术的成熟，基因组挖掘在微生物天然产物发现研究中得到了广泛的应用，成为微生物天然产物新结构发现的重要手段。微生物培养条件与微生物次级代谢产物的关系密切，是激活微生物沉默基因的重要方法之一。在本课题中，以枯草芽孢杆菌为检定菌株，对吸水链霉菌LP93（Streptomyces hygroscopicus LP93）的发酵培养基及发酵条件进行优化，确定最佳的氮源为黄豆饼粉 3.0% +(NH4)2SO4 0.5%、最佳碳源为葡萄糖 3.5%、发酵72h时补加1%葡萄糖和0.5%黄豆饼粉、最终发酵96h。对发酵产物的高效液相色谱分析和LC-MS数据分析，发现了以前未分离到的新化合物类型，紫外光谱在253nm处有最大吸收。采用硅胶色谱、凝胶色谱、高效液相色谱等分离方法，从大量发酵菌丝体中分离到20个化合物，经紫外光谱、红外光谱、一维和二维核磁共振光谱、质谱、圆二色谱等波谱学方法综合分析，鉴定了其中15个化合物的结构。其中洋橄榄叶素类化合物8个，新化合物2个，波拉霉素类化合物5个，新化合物3个，另有邻苯二甲酸二丁酯和一个异黄酮类化合物染料木素。化合物的抗菌实验表明，洋橄榄叶素和波拉霉素类化合物对耐药表皮葡萄球菌、耐药金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌等多种耐药菌具有很好的抗菌活性，MIC值为0.5-64ug/mL。MTT试验表明，洋橄榄叶素化合物对人大肠癌细胞 (HCT-8, HT-29), 人乳癌细胞 (MCF-7, MDA-MB-231)等多种细胞株具有显著的细胞毒活性，IC50为0.48-9.89 μM。这些实验结果表明，所分离到的化合物在生物农药、抗耐药菌药物、抗癌药物开发方面具有一定的潜力，它们的抗菌、抗癌机制值得进一步研究。