盐生植物花花柴耐盐和抗氧化分子机理的研究

新疆荒漠区盐生植物长期生长在高盐渍化的土壤中，形成了与盐胁迫相适应的形态结构、生理功能和独特的耐盐分子机理。本项目以新疆荒漠环境生长的盐生植物花花柴为研究对象,通过花花柴种子萌发和幼苗生长对盐胁迫产生的生理响应特性，确定花花柴的耐盐阈值；建立不同盐浓度胁迫的差减cDNA文库，通过差减cDNA文库和RACE 技术克隆花花柴的耐盐和抗氧化相关基因，进行实时定量PCR和核酸杂交分析，探讨花花柴耐盐和抗氧化相关基因表达水平存在的差异；开展转耐盐和抗氧化相关基因花花柴植株的分子检测与盐胁迫筛选，获得花花柴的转基因植株，探讨耐盐和抗氧化基因转化过表达对花花柴耐盐性的影响；构建花花柴根、茎、叶组织的microRNA文库，开展RNA干涉后花花柴基因表达和生理指标测定，分析特异表达的microRNA的功能。初步阐明花花柴的耐盐调控分子机理，并利用独特泌盐生植物花花柴改良盐碱土壤提供背景资料和奠定理论基础。

通过项目开展已完成了预定的研究任务，主要研究进展如下：.研究发现逆境胁迫直接影响花花柴种子的萌发，采用不同浓度NaCl和等渗的PEG6000 (聚乙二醇) 处理花花柴种子，结果表明NaCl和PEG胁迫对花花柴种子的萌发具有非常明显的抑制作用，能够降低种子的萌发率，延长种子的萌发时间，抑制胚根和胚芽的生长； NaCl对种子萌发的抑制作用明显大于等渗PEG；花花柴种子萌发的耐盐临界值为213 mM，极限值为340 mM。.利用抑制消减杂交(SSH)技术构建了盐生植物花花柴在盐胁迫下的cDNA文库，对EST序列进行分析和功能归类。结果表明71个差异表达的EST中有43个与已知的蛋白序列相似，22个与功能未知序列相似，6个未知序列。随机挑选7个EST通过半定量RT-PCR进行盐胁迫下的表达分析，结果显示，11E11，5G7，10B10为上调表达EST，而10A4, 6E9，7E9为下调表达EST，只有16F5在盐胁迫前期为上调表达，随着时间延长，表达量逐渐减少。 .花花柴愈伤组织分化与植株再生优化研究表明最佳的愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.4 mg/L，愈伤组织分化的最佳培养基为MS+6-BA 0.4 mg/L + NAA 0.5mg/L，诱导根的最佳培养基是1/2MS+NAA 0.2mg/L，并且诱导率达95%以上。利用半定量RT-PCR方法对花花柴愈伤组织中耐盐基因NHX1和NHX2的表达进行检测，结果显示NHX2在不同盐浓度(100,200,300mM)胁迫下可持续高表达14 d，而NHX1的表达变化不大。处理到第21 d时，在200 mM NaCl处理组两个基因的表达达到高峰，且NHX2的表达水平要比NHX1高。.通过高通量测序方法solexa技术构建了盐胁迫下花花柴的miRNA文库，筛选出差异miRNA，得到9个上调miRNA，14个下调miRNA，具有差异的miR396、miR166、miR164、miR827等是参与干旱、盐胁迫相关的miRNA。用同源克隆法获得miR398和miR395的靶基因CSD2和APS1的部分序列，加尾RT-PCR获得miR398和miR827的成熟序列，荧光定量PCR验证miR827和miR398是参与盐胁迫相关的下调的miRNA，证实花花柴miR398和靶基因CSD2之间的负调控关系。