猪MHC-DQB、DRB1基因近端调控区多态及启动子区甲基化研究

申请者认为影响结构基因表达的近端调控区多态性和启动子区甲基化是猪MHCⅡ类分子产生高度多态的一种新机制。本项目以猪MHC-DQB和DRB1基因 5＇上游近端调控区和启动子区（包含外显子1）为研究对象，分析5＇上游近端调控区的多态性；分析确定调控区的调控元件和不同调控区序列与相应结构基因的连锁格局；利用EMSA技术分析近端调控区的多态位点对调控因子与调控区结合差异以及近端调控区的多态位点对转录因子与调控区间亲和性差异的影响，同时利用荧光定量PCR技术分析不同近端调控区对相应结构基因表达的影响。利用荧光定量PCR技术结合MeDIP技术分析启动子区域（包含外显子1）中的甲基化水平并利用亚硫酸盐测序技术进行甲基化模式精细制图，分析其与结构基因表达的关系。综合研究结果以初步阐明近端调控区多态性和启动子区甲基化对结构基因表达的影响。项目的实施有助于为探索猪MHCⅡ类分子高度多样性机制开辟新的途径。

在前期工作基础上，我们提出近端调控区多态性和启动子区甲基化可能影响结构基因的表达，因而可能是猪MHCⅡ类分子产生高度多态的一种新机制。为验证这一设想，本项目利用PCR产物测序技术研究了5＇上游近端调控区的多态性；分析了不同调控区序列与相应结构基因的连锁格局；利用荧光素酶报告基因系统研究了近端调控区的多态位点对启动子区活性的影响，利用荧光定量PCR技术研究了不同近端调控区对相应结构基因表达的影响。利用焦磷酸测序技术研究了启动子区域的甲基化情况。结果表明：猪MHC Ⅱ类基因DQB和DRB1启动子区存在丰富的多态性；近端调控区与相应结构基因连锁格局存在可变性；近端调控区的多态位点影响了启动子区的活性并影响了结构基因的表达；研究了87个猪样本的MHC Ⅱ类基因DQB和DRB1启动子区甲基化情况，发现DQB和DRB1启动子区甲基化频率分别为7.48%和4.44%，87个测序样品中只有1个样本的DQB启动子区发生了甲基化（甲基化频率超过20%），其他样本的DQB和DRB1启动子区都没有发生甲基化。综合以上研究结果，我们认为启动子区的多态性是猪MHC Ⅱ类基因产生高度多态的又一种机制。但启动子区的甲基化不是猪MHC Ⅱ类基因高度多态产生的一种机制。项目的实施为探索猪MHCⅡ类分子高度多样性机制开辟了新的途径。