基于SAGE技术的视觉剥夺大鼠针刺响应基因的克隆、鉴定及表达分析

Amblyopia is one of the major diseases that seriously affect the children’s eyesight, its prevalence rate is 3-3.8% in Chinese population, and also, it is the top list of visual impairment. Acupuncture on Amblyopia has a bright prospect. This program is based on works we have done before, embrace “abnormal expression of Visual cortex plasticity related genes that caused by Disturbance of visual environment after Visual deprivation is the visual central mechanism” research hypothesis. By Duplicating monocular visual deprivation model rats, with the help of serial analysis of gene expression (SAGE) and High-throughput genomics technology, to explore the different expression of Visual plasticity-related gene after monocular visual deprivation from genomic level, also, to reveal the molecular mechanism of critical period regulation of Visual plasticity. Based on this basis, a further study of acupuncture treatment on Amblyopia response gene screening, cloning and identification will be continued, also, take an expression analysis of its Characterization proteins, extract at least 1 whole cDNA of acupuncture treatment on Amblyopia response genes, Protein expression and purification also needed aim at the cloned response cDNA, study on its anti Amblyopia activity, try to illuminate the molecular mechanisms and effect of visual deprivation by treatment of acupuncture, in order to provide some New ideas and evidences of Acupuncture intervention and regulation on Biological mechanism of visual system plasticity changes.

弱视是严重影响儿童视功能健康的主要疾病之一，国内患病率为3-3.8%，居视力残疾致病之首位。针灸治疗弱视显示了较好的临床前景。弱视主要受损部位在视皮质，本项目结合前期工作基础和资料，围绕“敏感期内视觉剥夺后视环境功能紊乱导致的视皮层可塑性关键基因表达异常是弱视发生的主要中枢机制”的研究假说，通过复制单眼视觉剥夺弱视模型，借助基因表达序列分析法（SAGE）等高通量基因筛选技术平台，从基因组角度探讨单眼视觉剥夺后视觉可塑性相关基因的表达，试图从视觉可塑性关键期内关键基因的筛选和调节入手，初步揭示视觉可塑期调控的分子机制，并进一步筛选、克隆和鉴定针刺治疗弱视的响应基因，并对其表征蛋白进行表达分析，钓取至少1个针刺治疗弱视响应基因的全长cDNA克隆，对其进行蛋白纯化与活性研究，揭示和阐明针灸治疗弱视的分子机制，也为针刺干预和调节视觉系统可塑性变化的生物学机制提供新的思路和依据。

弱视是儿童视觉发育期常见的难治性眼病之一，其发病率日益增加。其发病与视通路及视神经元结构和功能异常密切相关。前期研究表明，针刺治疗儿童弱视疗效确切，可调节视通路和视皮层的可塑性改变，但具体作用机制还未完全阐明。本研究借助高通量基因筛选技术，检测分析了单眼视觉剥夺后视皮质区相关基因的表达变化，提取视皮质组织mRNA，建立了转录组文库，利用全转录组基因测序技术和VEEN分析法，钓取了特异性针刺响应基因，并对响应基因进行了GO富集分析、Pathway分析和功能描述。预测了针刺响应基因参与的分子信号通路及作用靶点，并结合整个信号通路对其生物学功能进行预测；最后，钓取了2个特异性针刺响应基因，利用SYBR Green荧光定量PCR技术进行了扩增验证。研究结果发现：共获得左侧视皮质针刺响应基因共38个，右侧视皮质针刺响应基因63个；获得左侧视皮质不同生物学功能的差异基因GO条目11个，包括参与生物过程的1个、参与细胞组分的6个、参与分子功能的4个。获得右侧视皮质差异基因GO条目29个，包括参与生物过程的9个、参与分子功能的10个和参与细胞组分的10个。左侧针刺响应基因共参与调控了31个视功能相关代谢通路，右侧针刺响应基因共参与调控了45个视功能相关代谢通路。最终筛选出Grm2基因介导的mGluRs信号通路和Pla2g2a基因介导的Alpha-Linolenic acid metabolism信号通路可能与针刺调控视功能可塑性的生物学机制具有密切相关性。研究结论：①单眼视觉剥夺大鼠视皮质中存在相关基因的异常升高或降低，并由此诱发视通路传递效率的降低和视功能的紊乱，这可能构成了弱视发病的主要分子生物学机制。②针刺干预视觉剥夺的分子机制可能是基于对视皮层特定响应基因的表达调控而实现了视功能的重塑。以上研究结果为弱视的发病机制研究和针刺治疗弱视的神经生物学效应机制研究提供了新的参考依据。