基于嗜热、嗜温及嗜冷菌来源的三种高度同源蛋白酶的温度适应性分子机制研究

To support normal growth of microorganisms adapted to different temperatures, the enzymes from thermophiles, mesophiles and psychrophiles usually function optimally at high, moderate and low temperatures, respectively. Since proteases play key roles in many physiological processes, the investigation of molecular basis for temperature adaptation of proteases is of great importance for the understanding of the adaptation mechanism of microorganisms. In this research proposal, we are going to probe the temperature adaptation mechanism of proteases using three highly homologous psychrophilic, mesophilic, and thermophilic subtilases. Firstly, we will perform comparative analysis of the properties of the three enzymes, in terms of stability, activity, substrate preferance, autoproteolysis-resistance,etc.. Then, a series of chimera will be constructed by exchanging non-conserved fragments of these enzymes, and will be characterized, in order to identify key structural elements involved in temperature adaptation of the enzymes. Finally, we will perform random shuffling of the genes of the three subtilases, and screen thermostable chimeric enzymes with high low-temperature activity. We hope this study could provide new insight into the molecular basis of subtilases adapted to different temperatures. In addition, the elucidation of temperature adaptation mechanism of subtilases is expected to provide a rational basis for developing new proteolytic catalysts for commercial and industrial uses.

嗜热、嗜温及嗜冷菌来源的酶分别在高温、中温及低温条件下最大限度地发挥其催化功能，以保证微生物在相应温度条件下正常生长。蛋白酶在微生物生理代谢过程中发挥关键作用，对其温度适应分子机制的研究对深入理解微生物的适应机理具有重要的科学意义。本项目利用嗜热、嗜温及嗜冷菌来源的三种蛋白酶（Subtilases）所具备的高同源性这一优势，在对这组酶进行系统比较研究的基础上，通过高效构建涵盖全部非保守区（位点）的系列嵌合体，寻找决定这组酶温度适应差异性的关键区域（位点）并阐明及其作用方式，进而揭示它们的温度适应分子机制，探寻微生物蛋白酶在通过分子进化而实现功能优化的过程中所蕴含的规律，丰富人们对（极端）微生物适应机理的认识。同时，对Subtilases温度适应机制的深入理解，在应用方面将为制备稳定性好且活性高的新型蛋白酶制剂提供新的理论依据。

本项目利用嗜热菌、嗜温菌及嗜冷菌来源的三种蛋白酶（WF146、Sph及S41）具有高同源性这一优势开展酶温度适应分子机制研究。通过N端前肽互换构建嵌合体酶原，发现嵌合体酶原的成熟速度较野生型酶原发生显著改变。而且，其中一种嵌合体酶原所形成的成熟酶比野生型酶原形成的成熟酶的活性低，暗示N端前肽可通过“蛋白质记忆”的方式影响成熟酶性质。通过对WF146成熟机制研究，发现N端前肽与成熟酶区之间连接肽的柔性特征使得该酶可通过顺式和反式加工去除N端前肽，而且Ca2+结合引起的结构调整对该酶在高温条件下有效成熟至关重要。在缺Ca2+条件下，WF146酶原通过顺式加工形成的一种特殊中间体复合物可在低温条件下重新合成肽键并恢复成酶原。我们将WF146成熟酶区非保守的氨基酸残基或区域（VR）逐一换为S41和Sph的相应VR，鉴定到了多个来自S41和Sph的对酶热稳定性和活性具有显著影响的关键结构元件。部分嵌合体通过降低稳定性来提高低温活性，符合酶稳定性和活性关系的“代偿”（Trade-off）规律；另有部分嵌合体的稳定性和活性同时升高或同时降低，表明稳定性和活性之间并没有必然的内在联系。通过对鉴定到的结构元件进行系列重组和筛选，成功获得了热稳定性和活性显著高于野生型WF146蛋白酶的嵌合体PBL5X，该嵌合体含有来自S41的7个VR。这表明，来源于嗜冷酶S41的结构元件能够显著提高嗜热酶WF146的热稳定性及活性。PBL5X热稳定性提高源自多种稳定相互作用的累加效应，包括二级结构稳定性增强、氢键增加以及局部疏水相互作用提高等。值得关注的是，PBL5X“模拟”了嗜冷酶S41适应低温环境的分子策略，一方面增加底物结合区域的柔性来降低催化反应的能碍及促进产物释放，另一方面提高活性位点催化三联体的稳定性来促进催化残基之间的相互作用，从而提高活性。这一发现不仅从结构-稳定性-活性关系的角度更好地解释了酶的温度适应机制，同时还为人们改造天然蛋白酶从而获得应用领域亟需的高稳定性、高活性的Subtilase提供了新的设计依据。