超嗜热古菌蛋白酶Pyrolysin响应温度变化的分子机制

Hyperthermophiles living in marine hydrothermal vents are not only resistant to high temperatures but also able to cope with temperature variations due to seawater convection. As the major executors in cellular physiology and metabolism, enzymes play important roles in these processes. Pyrolysin is an extracellular serine protease of heterotrophic hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus isolated from geothermally heated marine sediment. This enzyme is one of the most thermostable proteases known and is the prototype of the pyrolysin family of the subtilisin-like serine protease superfamily (subtilases). Recently, we found that pyrolysin can self-assemble into amyloid-like fibrillar aggregates in artificial seawater at low temperatures. To the best of our knowledge, there is no report on self-assembly of hyperthermophilic enzymes into amyloid-like fibrils under non-denaturing conditions. Based on this new finding, we hypothesize that pyrolysin may cope with temperature variations through adjustment of its aggregational, structural, and functional states, and thus propose this research project. The main objective of this project is to elucidate the molecular basis for temperature variation-induced response of pyrolysin. We will focus on the relationships and differences among fibrillar aggregation, molecular structure and enzymatic function of pyrolysin under various temperature conditions. A series of pyrolysin variants will be constructed to identify the key structural elements involved in self-assembly and temperature response of the enzyme. The results of this study will provide new insight into temperature adaptation mechanism of hyperthermophilic enzymes and deepen our understanding of biological characteristics of hyperthermophiles.

海洋超嗜热微生物不仅耐受高温，还具备应对海水流动造成环境温度变化的生存能力，酶作为细胞生理代谢的主要执行者在其中发挥重要作用。Pyrolysin（Pls）是海洋超嗜热古菌Pyrococcus furiosus的胞外蛋白酶，是已知的热稳定性最好的蛋白酶之一。我们最近发现Pls在人工海水中于低温条件下可自组装形成规则的纤维状聚集物，这种在非变性条件下的纤维化自组装现象在有关超嗜热微生物酶的研究中未见报道。根据这一新现象，我们提出Pls通过调整自身聚集形式以及结构和功能状态以应对温度条件变化的假设。本项目将重点研究Pls的聚集形式、结构特征和功能状态这三者之间的相互关系，以及这三者在不同温度条件下的差异性，寻找在其中发挥作用的关键结构元件并阐明其作用方式，进而揭示Pls自组装及响应温度条件变化的分子机制。研究结果将为超嗜热微生物酶的温度适应机制提供新见解，深化人们对超嗜热微生物生命特征的认识。

海洋超嗜热古菌Pyrococcus furiosus不仅耐受高温，还具备应对海水流动造成环境温度变化的生存能力。本项目针对该菌胞外蛋白酶Pyrolysin响应温度变化的分子机制开展研究。通过分析各种环境因子与该酶聚集状态、结构特征和功能状态的相关性，发现Pyrolysin成熟酶（mPls）在人工海水中具有形成纤维状聚集物的能力，而低温条件有利于该聚集物的形成。蛋白和肽类底物不仅可有效防止mPls发生沉淀，而且可以使已聚集酶分子解聚。这提示我们，当P. furiosus随海水扩散至低温区时，Pyrolysin可聚集在细胞表面，减少因海水流动造成酶的流失。当底物存在时，酶分子通过底物结合部位与底物发生互作而诱导酶分子结构发生调整，使得酶分子解聚而发挥活性。这些结果表明，Pyrolysin可通过调整自身的聚集状态响应温度变化。Pyrolysin的N端前肽（PlsN）具有帮助该酶正确折叠的分子伴侣功能及抑制mPls活性的作用。与同源蛋白酶的N端前肽相比，PlsN具有一个额外的N端肽段G1-I33，该肽段的缺失导致N端前肽的高温条件下发生热降解，进而影响N端前肽在高温条件下的抑制剂功能。因此，PlsN的特征性结构是该酶响应高温条件的一个重要内在因素。研究还表明，该菌S层蛋白可提高mPls的活性及热稳定性。Pyrolysin是已知的热稳定性最好的蛋白酶之一，而本项目研究通过引入Pro残基和稳定的二级结构、修饰钙离子结合位点和删除自降解位点可将该酶在95C的半衰期由原来的12小时提高到60小时以上，这为我们探索蛋白质耐受极端高温条件的分子机制提供了新的信息。另外，本研究发现Pyrolysin具有降解鱼鳞胶原蛋白的能力，而所得到的鱼鳞胶原蛋白降解产物可显著提高Pyrolysin在高温条件下的酶活性和稳定性，这不仅暗示P. furiosus及其胞外蛋白酶在海洋沉积物有机氮化合物循环中发挥作用，也反映出Pyrolysin与底物之间的互作是该酶适应海洋高温环境的一种重要方式。总体而言，本研究为探索蛋白质耐受极端高温条件及响应温度变化的分子机制提供了新的信息，有助于我们深入理解超嗜热古菌的适应机理，并为人工设计和构建稳定性好的生物催化剂提供了新思路。