药用昆虫美洲大蠊抗肺纤维化物质基础及作用机制研究

The material basis for efficacy and mechanism of anti- pulmonary fibrosis（IPF） in Periplaneta Americana remains unclear, though a potent part, named ML-D-Ⅲ has been achieved in our previous research. ML-D-Ⅲ extracted from Periplaneta Americana was found capable of significantly inhibiting pulmonary fibrosis replication with relatively low cytotoxicity. In this proposed research, we will do further systematic research on ML-D-Ⅲ. (1) the compounds are separated from active site ML-D-Ⅲ by Gel Chromatography, HPLC, Electrophoresis etc, and identified by IR,NMR, MS, polypeptide N-terminal amino acid sequencing etc, and tested in vitro and in vivo anti-pulmonary fibrosis properties. (2) The study objectives are to evaluate the efficacy of the active site of a single and component effect and explore the activity being governed by a single component or components produced by synergy by using Bleomycin-induced rat model of pulmonary. (3) MTT was used to study the inhibitory effect on the replication cycle factors of MRC-5 cell stimulated by TGF-β1, with the attempts to make clear the mechanism of anti-IPF of ML-D-Ⅲ and various compounds in ML-D-Ⅲ. Yunnan provincial government has listed the research and development of its relevant drugs as one of the five series of "Yun medicine" cultivated in Yunnan Province. The results will lay an important scientific foundation for the development of high efficacy, low toxicity, rich resource in anti- IPF.

课题组在对药用昆虫美洲大蠊的前期研究中，获得了抗肺纤维化（IPF）作用很强的活性部位ML-D-Ⅲ，但其活性物质基础和作用机制尚未完全清楚，课题将进一步对其进行系统研究，研究内容包括：（1）在体内外活性追踪下，采用凝胶过滤色谱、制备HPLC、电泳等技术系统分离活性部位ML-D-Ⅲ中的化合物，并采用四大波谱、多肽N端氨基酸测序及多种联用技术确定化合物结构；（2）采用博莱霉素诱导大鼠肺纤维化模型对活性部位和单体化合物进行抗IPF药效评价，探讨抗IPF活性是由单一成分产生还是由多成分协同作用产生；（3）采用MTT法研究ML-D-Ⅲ和各化合物对TGF-β1刺激诱导人胚肺成纤维细胞(MRC-5)复制周期相关因子的抑制作用，以阐明其抗IPF的作用机制。 美洲大蠊系列药品的研发是云南省重点培育的五大系列"云药"特色产品之一，研究成果将为最终研发出一种高效、低毒、资源丰富的抗IPF新药奠定基础。

课题组在对药用昆虫美洲大蠊的前期研究中，发现其提取物具有较好的抗肺纤维化（IPF）活性，但其活性部位、物质基础和作用机制尚不明确，项目先后对美洲大蠊提取物进行分离、纯化、活性追踪、作用机制等系统研究，主要研究内容体现在：. 1.采用不同类型的吸附树脂对美洲大蠊提取物进一步进行分离纯化，寻找最好分离材料，并结合体外活性追踪，得到最佳活性部位；. 2.采用凝胶过滤色谱、制备HPLC、电泳、膜分离等技术，系统分离活性部位中的化合物，并采用四大波谱、多肽N端氨基酸测序及多种联用技术确定化合物结构；. 3.采用MTT法，研究活性部位对肺纤维化相关因子表达的影响，及对TGF-β1刺激诱导人胚肺成纤维细胞(HEL)复制周期相关因子的抑制作用，阐明其抗IPF的作用机制；. 4.分别采用博莱霉素和SiO2诱导大鼠肺纤维化模型，探讨活性部位抗IPF的作用机制及安全性。 .通过研究，现已按预定目标完成了相关研究内容，取得了以下成果： . 1.通过正交试验结合体外活性，优选出抗肺纤维化最佳的活性部位和最佳提取工艺；. 2.通过体内、外活性实验，进一步研究了美洲大蠊抗肺纤维化活性，初步阐明了美洲大蠊抗肺纤维化的作用机制；. 3.建立了美洲大蠊抗肺纤维化活性部位的药效指纹图谱；. 4.从活性部位中分离得到32个化合物；. 5.从美洲大蠊中筛选出具有抗肝纤维化活性部位，并于2016年1月获国家自然科学基金资助，项目名称“药用昆虫美洲大蠊抗肝纤维化肽/糖肽及其对HCS与相关细胞因子表达的影响”，项目编号：81560634 。. 6.培养了10位硕士研究生；发表了15篇文章，另有3篇接到用稿通知；申请国家发明专利3项。. 该项目的成功实施，优选了美洲大蠊抗肺纤维化活性部位的分离纯化工艺，基本明确了美洲大蠊抗肺纤维化活性的物质基础及作用机制。研究成果为进一步研究美洲大蠊抗纤维化新药奠定重要基础。