GRα介导钙离子信号调节猪骨骼肌细胞应激凋亡的研究

Recently, much attention has been focused on the relationship between poor meat quality and glucocorticoid （GC） caused by stress. However, molecular mechanism under the elevated GC levels led to poor meat quality is not very clear so far. We previously showed that high concentrations of GC led to skeletal muscle cell apoptosis accompanied with high calcium level appeared in the cytoplasm. Then, we infer that the elevated GC may regulate calcium channels through glucocorticoid receptor α (GRα), subsequently leading to increased calcium in the cytoplasm and to further stimulate the calcium-dependent apoptotic signal, which could in turn affect meat quality. On the basis of our previous study, we use pig primary muscle cells to build a cellular stress model and then to study how calcium signaling disorders affect the survival of porcine muscle cells, how GC control the calcium signaling pathway and how GRα regulates calcium channel gene by this cell model using flow cytometry, quantitative PCR, western blot, site-directed mutagenesis, electrophoretic mobility shift assay (EMSA), chromatin coimmunoprecipitation (ChIP), over expression and siRNA method. And we also want to verify the relationship between GC, calcium signal, muscle cell apoptosis and poor meat quality in vivo model. The present study is of significant importance to elucidating the inherent mechanism that how stress affect meat quality and to provide a theoretical basis for anti-stress and high meat quality pig breeding, as well as to take reasonable measures to reduce the loss caused by stress.

近年来猪应激后肉质下降与应激激素糖皮质激素（GC）之间的关系倍受人们关注，但迄今为止，GC含量升高导致肉质劣变的机理尚不清楚。前期研究中，我们发现高浓度的GC可致使骨骼肌细胞凋亡且胞质中钙离子大量聚集。我们推测，升高的GC可能通过GRα调控钙离子通道，导致胞质中钙离子升高而激发依赖钙离子的细胞凋亡信号，引起肌细胞的应激凋亡，致使肌细胞的理化状态变化，进而影响肉质。本项目利用猪原代肌细胞应激模型，采用流式细胞术、定量PCR、免疫印迹、定点突变、凝胶电泳迁移实验、染色质免疫共沉淀、过表达与干扰等手段探讨钙离子信号紊乱对猪肌细胞存活的影响、GC对钙离子信号的调控作用、GRα对钙离子通道基因的调控机制，并在体内试验中验证GC肌细胞凋亡、钙离子信号与肉质下降之间的关系。本课题将进一步挖掘应激状态下肉质劣变的内在机制，为选育抗应激和高品质肉质猪，以及采取合理的措施减少应激造成的危害提供一定的理论依据。

近年来猪应激后肉质下降与皮质醇之间的关系倍受人们关注，但迄今为止，皮质醇含量升高导致肉质劣变的机理尚不十分清楚。由于前期中研究发现高浓度的糖皮质激素可致使肌细胞凋亡且胞质中钙离子大量聚集。因此，我们首先使用钙离子过载和拮抗技术证明肌细胞中钙离子的紊乱与细胞凋亡存在直接的关系。接下来利用转录抑制与干扰技术证明糖皮质激素发挥作用的关键因子GRα是在转录水平上对钙离子通道基因IP3R1的调控作用。此后，利用染色体步移、生物信息学手段、干扰与定点突变、凝胶阻带电泳（EMSA）和染色质免疫共沉淀（ChIP）等技术确定钙通道蛋白基因IP3R1启动子序列中存在GRE元件，并且GRα通过与该启动子结合在转录水平上来调控其表达。利用直接饲喂皮质醇构建仔猪应激模型，验证细胞中的实验结果，并通过高通量的测序技术筛选差异表达的关键基因与信号通路。结果表明应激组中血清中的皮质醇水平显著增加、宰后1 h肉色、肌束比率、肌细胞凋亡率、钙离子通道和细胞凋亡相关基因包括SERCA1、IP3R1、BAX、Bcl-2和Caspase-3的表达水平显著上升。Western blot分析表明应激组中组Desmin、IGF-1和 MyoD1蛋白水平低于对照组，而ATF4、CAST、calpain1和calpain2蛋白水平高于对照组。此外，宰后24 h滴水损失以及血清中CK的含量显著下降。通过转录组测序筛选出大量的差异表达基因，发现223个差异表达基因，包括80个上调基因和143个下调基因。有204个基因富集到GO条目，140个基因注释到KEGG数据库。许多差异基因介导炎症、免疫和损伤应答的反应过程。一些差异表达基因富集到与应激相关的信号通路中，包括P53信号通路、TGFβ信号通路、凋亡信号通路和MAPK信号通路。与钙离子通道和细胞凋亡相关的差异基因同样被筛选出来，如TLR3、IL-1RAP等。本研究推断出应激通过皮质醇影响TLR3和IL-1RAP的表达引起NF-κB的活化，以及通过GRα直接介导钙离子通道的变化，进而作用于如Caspase-3、Bcl-2和BAX等凋亡有关蛋白诱导细胞凋亡，引起肌肉组织的理化性质的改变，最终导致肉质的劣变。本项目的研究将为选育抗应激和高品质肉质猪，以及采取合理的措施减少应激造成的危害提供一定的理论依据。