氧化应激条件下IGFN1对猪骨骼肌细胞MAPK信号通路的调控机制

Swine immunoglobulin-like and fibronectin type III domain containing 1 (IGFN1) gene is a novel gene, which has been found in recent years. On the basis of previous animal experiment, scientific problems on the involvements of IGFN1 in the activation of MAPK signaling pathway were studied using research tools of molecular biology and cell physiology. In this study, pig skeletal myoblasts is the object. The study focus on: (1) the gene expression pattern of IGFN1 and the activation of MAPK signaling pathway under oxidative stress; (2) the effect rule of expression of IGFN1 on the MAPK signaling pathway under oxidative stress by gene overexpression and siRNA knockdown; (3) Searching for interacting protein with IGFN1 in MAPK signaling pathway through bioinformatic predictions, tandem affinity purification, Co-Immunoprecipitation and GST pull-down and other methods. The goal of this study is to illustrate the regulating mechanism of IGFN1 on porcine MAPK signaling pathways under oxidative stress. Expected results will fill the domestic blank of pig IGFN1 gene function study. Furthermore, this project will provide the scientific basis for stress damage repair, and is significant for improving the quality of pork.

围绕近几年新发现的免疫球蛋白样和纤维连接蛋白Ⅲ型域含蛋白质1（IGFN1）基因，在前期动物试验基础上，针对氧化应激条件下IGFN1参与MAPK信号通路的活化这一科学问题，采用分子生物学和细胞生理学等研究手段，以猪骨骼肌成肌细胞为对象，重点研究：（1）氧化应激过程中IGFN1基因表达规律和MAPK信号通路活化情况；（2）通过基因转染使细胞过表达IGFN1和siRNA敲低内源性IGFN1的表达，明确氧化应激条件下IGFN1表达对MAPK信号通路的影响规律;（3）通过生物信息学预测、串联亲和纯化、免疫共沉淀和GST pull-down等方法寻找MAPK信号通路中与IGFN1相互作用的蛋白，初步探明氧化应激条件下IGFN1对猪骨骼肌细胞MAPK信号通路的调控机制。预期结果将填补国内外猪IGFN1基因功能研究的空白，为氧化应激条件下修复肌肉损伤及改善猪肉品质的深入研究提供新思路。

氧化应激是畜牧生产中造成猪肉品质下降的重要原因。免疫球蛋白样和纤维连接蛋白Ⅲ型域含蛋白质1（immunoglobulin-like and fibronectin type III domain containing 1, IGFN1）基因可在骨骼肌中特异性表达，参与蛋白翻译、肌细胞的分化和细胞骨架的稳定，但其是否参与氧化应激引起的MAPK信号通路的活化还悬而未决。. 本项目以H2O2处理原代猪骨骼肌成肌细胞，浓度分别为0.1、0.2、0.4和0.8 mM，培养时间为0.5 h和1.5 h。根据细胞存活率确定0.1 mM H2O2培养1.5 h后可建立成肌细胞的氧化应激模型。分别构建IGFN1基因过表达和沉默的慢病毒质粒载体，将病毒成功包装后感染猪骨骼肌卫星细胞，培养72 h后，再加入含2%马血清的DMEM/F12分化培养基诱导分化，继续培养3 d后向细胞中加入0.1 mM H2O2，培养1.5 h后收集细胞，检测IGFN1蛋白的表达和MAPK信号通路的活化情况。结果发现，猪骨骼肌成肌细胞中IGFN1的过表达或敲低表达均不会影响MAPK信号通路的活化。但氧化应激条件下，成肌细胞中IGFN1的过表达会抑制p38的磷酸化，但不会影响ERK和JNK的磷酸化水平；而氧化应激条件下，成肌细胞中敲低IGFN1基因的表达会显著增加p38和ERK的磷酸化水平，但对JNK无影响。同时还发现，氧化应激条件下，成肌细胞中敲低IGFN基因的表达会促进活性氧的释放，但IGFN1的过表达却不会影响细胞活性氧的释放。此外，采用串联亲和纯化技术筛选与IGFN1互作的蛋白，搜库发现7个重要蛋白肽段，其中HSPA8是HSP70家族重要成员，是今后研究的一个重要蛋白。. 项目从细胞水平探明IGFN1基因可在氧化应激条件下参与MAPK信号通路的活化，研究将发展和丰富应激影响猪肉品质的理论基础，可为国内外猪IGFN1基因功能的研究提供新的科学依据，也为氧化应激条件下修复肌肉损伤及改善猪肉品质的深入研究提供新方向。同时，本项目还获得了高特异性的猪IGFN1蛋白多克隆抗体，可为IGFN1在猪组织中的表达分析及其相关研究提供重要工具。