LARG/RhoA信号转导通路的新型小分子探针的核磁片段筛选与组装

Small GTPase RhoA is cycled from the inactive GDP bound conformation to the active GTP bound conformation, activated by its guanine nucleotide exchange factors (GEFs), to trigger the downstream cascade, while the deregulation of this signal transduction pathway would lead to the uncontrolled tumor cell growth and migration. Recently, the discovery of small molecules to regulate such GEF/RhoA pathway has attracted much interests, especially the compounds to block the protein-protein interactions or to trap the complex in their inactive conformation. We plan to setup the first highly automated NMR fragment based screening facility in China, initially targeting the complexes of Leukemia Associated Rho Guanine nucleotide exchange factor (LARG) and its upstream Plexin-B1 and downstream RhoA, respectively. Novel NMR techniques, e.g., Residual Dipolar Couplings and PseudoContact Shifts, will be deployed to retrieve the valuable structural information of the distance and orientations between target proteins and the fragment hits, which provides a harw eyed view of the follow-up fragment assembling to novel potent ligands. The success of our research would make a breakthrough in solving the weak interaction between protein and fragment hits by conventional NMR/X-ray methods in fragment based lead discovery. Our reseach would shed light on the molecular basis of the tumor cell migration, via the studies of biophysical affinity and biochemcial assays in vitro, as well as the whole cell migration, probed by those compunds to interfere with the LARG/RhoA signal transduction pathway.

小G蛋白RhoA与肿瘤细胞的生长和迁移密切关联，其活化受到上游的鸟苷交换因子调控。靶标鸟苷交换因子/小G蛋白的信号转导通路的小分子化合物，已逐渐成为抗肿瘤迁移药物研究的新热点。本项目拟分别以RhoA的鸟苷交换因子LARG与其上游的Plexcin-B1蛋白复合物和下游的RhoA复合物为靶点，创建中国首个（批）高度自动化的核磁小分子药物片段筛选平台，筛选抑制蛋白-蛋白作用或者将二者复合物稳定在失活状态下的新型苗头化合物。创造性的运用转移残留偶极耦合和准接触位移等核磁新技术，测量多个苗头化合物的相对取向和距离，在结构的基础上设计拼装新型的蛋白-蛋白复合物体系的小分子探针，尝试解决基于片段的药物发现中弱结合的蛋白/配基结构解析困难的瓶颈问题。进一步深入研究这类小分子化合物的体外亲和力、活性和它对肿瘤细胞迁移行为的影响，以此为小分子探针，阐明肿瘤细胞迁移的分子作用机制。

蛋白-蛋白相互作用的抑制剂被誉为药物发现的明珠。蛋白-蛋白相互作用界面狭长舒缓，传统的高通量筛选难以奏效。新兴的基于片段的先导化合物发现可有效地寻找到较弱亲和力的小分子苗头化合物，进而在结构的指导下设计优化为高亲和力的抑制剂。本项目紧密围绕着基于片段的先导化合物发现中的关键科学问题和技术难关。首先，我们建成了高度自动化的基于核磁共振的药物筛选设施，完成了包括LARG-RhoA体系在内的十多个蛋白-蛋白相互作用体系的片段筛选。其次，很多靶点蛋白存在低丰度的激发态构象，从而通过构象选择机制在分子识别、酶催化等生物学过程中发挥关键作用，然而这类低丰度构象很难通过晶体学或传统的核磁共振方法来表征。我们因此发展了核磁赝接触位移和化学交换饱和转移的新方法来获取蛋白质低丰度激发态的关键结构约束。同时发展了仅基于Ca原子的大蛋白体系主链指认的新方法，拓展了核磁共振可研究的蛋白质尺寸范围。针对蛋白和弱结合的苗头化合物的结构表征困难是基于片段的先导化合物发现中的一个关键难题，我们通过顺磁弛豫增强方法，构建了RhoGDI2和苗头化合物的结构模型，并在此基础上优化设计了一个新型的小分子抑制剂，并解析它与RhoGDI2的复合物晶体结构，为后续基于结构的先导化物发现奠定了基础。最后，考虑到项目原定研究的LARG体系的小分子亲和力较弱，难以优化为高活性的先导化合物，我们从识别乙酰化组蛋白的Bromo结构域这一新兴靶点出发，并和药物化学课题组密切合作，鉴定、设计合成并解析了一系列新型小分子和蛋白的复合物结构，分析了这些小分子的抗肿瘤细胞增殖活性，在结构指导基础上优化设计并鉴定了多个具有抗肿瘤细胞增殖活性的功能小分子。总体而言，我们攻克了蛋白-蛋白相互作用体系从片段苗头化合物到先导化合物的关键技术难题，为探索这类体系的生物学功能提供了重要的化学探针，并为潜在的药物发现提供了良好的出发点。共发表SCI论文6篇，专利授权一项，另有一篇论文在修改，一篇已投稿。