慢交换体系低丰度激发态构象的核磁共振研究新方法

Despite the critical roles of excited states in protein folding, catalysis and molecular recognition, they remain intractable for most structural studies because of their notably low populations. Chemical shifts for "invisible" states in slow exchanging with the ground state (~2-100 ms) are intuitively observed using NMR chemical exchange saturation transfer (CEST) experiments. It, however, remains a great challenge to rebuild the excited-state conformations using chemical shifts only. We have recently developed a new method to determine pseudocontact shifts of excited states, which carry valuable angular and distance information in these states. We, therefore, plan to study one or two slow exchanging systems with a characteristic conformational selection mechanism for protein-ligand recognition, e.g., the bile acid binding protein FABP6. We will further develop CEST based approaches to determine pseudocontact shifts and residual dipolar couplings of excited states, using the high resolution 850 MHz spectrometer in the High Magnetic Field Laboratory, CAS. Based on the critical structural restraints of chemical shifts, multiple pseudocontact shift datasets, and multiple independent residual dipolar coupling datasets for the low-populated excited states, we plan to generate for the first time the structural model of the excited states in a slow exchanging system. It enables the elucidation of the essential role of the pre-existing excited states in the conformational selection mechanism for protein-ligand recognition.

激发态在蛋白质的折叠、酶催化和分子识别等生物学功能上发挥关键作用。由于激发态的丰度太低，大多数的结构生物学方法难以表征激发态的构象。针对基态-激发态交换时间尺度在约2-100毫秒的慢交换体系，化学交换饱和传递（CEST）可直观测量激发态的化学位移。然而仅通过化学位移来重构激发态构象面临着巨大的挑战。我们近期开发了激发态赝接触位移测量的新方法，可获得激发态的距离和取向相关的关键结构信息。在此基础上，拟以胆酸结合蛋白FABP6等具有构象选择特性的1-2个慢交换体系为研究对象，发展完善赝接触位移及残余偶极耦合与CEST联用的新技术，依托稳态强磁场中心的高分辨率850 MHz核磁共振谱仪，获得低丰度激发态的化学位移、多套赝接触位移和残余偶极耦合数据，在这些重要结构约束的基础上尝试首次搭建慢交换体系的激发态结构模型。这将阐明预先存在的激发态构象在蛋白-配基分子识别的构象选择机制上所发挥的关键作用。

激发态在蛋白质的折叠、酶催化和分子识别等生物学功能上发挥关键作用。由于激发态的丰度太低，大多数的结构生物学方法难以表征激发态的构象。针对基态-激发态（或自由态-结合态）交换时间尺度在约5-1000 Hz的慢交换体系，核磁化学交换饱和传递或弛豫弥散可直观测量低丰度激发态/结合态的化学位移。然而仅通过化学位移来重构低分度构象面临着巨大的挑战。中等亲和力范畴的先导化合物的自由态和结合态常处于核磁中等交换到慢交换时间尺度，我们因此开发了赝接触位移和化学交换饱和传递或弛豫弥散联用的新方法，运用19F的化学交换饱和传递（CEST），测定了低丰度结合态的镧系金属标记的BRM bromo结构域的单F及双F小分子抑制剂的19F 赝接触位移（PCS）。我们命名这一新方法为19F PCS-CEST，它提供了蛋白-配基间的重要结构约束，从而挑选出分子对接的最佳结合模式，并与另一个高水溶性类似物的复合物晶体结构相一致。这一方法解决了中等亲和力范畴的先导化合物与靶标的低丰度结合态的核磁表征难题，拓展了核磁共振在结构指导的苗头化合物到先导化合物演化中的应用。我们进一步开发了赝接触位移和弛豫弥散联用的新方法，利用弛豫弥散获取配基结合态的氢原子赝接触位移，其中富含距离与方向的重要结构信息，我们将该新方法命名为1H PCS-RD。进而将这一新方法成功应用于鉴定符合实验约束的结合态构象。由于氢原子在类药分子中是普遍存在的，该方法有望在基于结构的药物先导化合物发现领域有更为广泛的应用前景。共发表标注基金号的研究论文10篇，其中9篇被SCI收录，包括Angew Chem Int Ed, J Phys Chem Lett (2篇)等。