对叶百部总生物碱止咳作用机制及其谱效关系的研究

As a commonly used traditional Chinese medicine, Stemona Radix is widely utilized clinically, being antitussive orally and insecticidal in vitro. Its antitussive activity is mainly due to its total alkaloids, and Stemona Tubernosa Radix(STR) is one of its main sources. In The Pharmacopoeia of the People's Republic of China (2010 edition), only character, identification and extract test of Stemona Radix are available, and quality of the crude drug can not be effectively controlled. Therefore, this project intends to conduct a study on the antitussive mechanism of the total alkaloids of STR from different areas of China on the basis of previous studies about preliminary quality evaluation of STR collected from Guangxi and neighboring provinces. Meanwhile, this project carries out pharmacodynamic study of STR total alkaloids and pharmacochemical study of the total alkaloids and serum containing the total alkaloids using HPLC-MS as well as techniques and methods of chemistry of Chinese materia, pharmacology of Chinese materia medica and serum pharmacochemistry, establishes HPLC fingerprints, and analyzes spectrum-effect relationship by measuring grey correlation degree to identify peaks that correlate to cough-relieving effect of STR total alkaloids. This projects aims to set up a quality evaluation system integrating chemical analysis and biological activity evaluation so as to disclose the mechanism and material basis of cough-relieving effect of STR, provide an experimental basis for development of effective, safe and quality-controllable antitussive new drugs and supply a scientific basis for perfection of quality standards of STR.

百部为中医临床常用中药，内服止咳、外用杀虫，应用广泛。总生物碱是其止咳活性的主要成分，对叶百部为其主要来源之一。《中国药典》2010年版百部项下仅有性状、鉴别、浸出物等项，不能有效控制药材质量。为此，本项目拟在前期对广西及周边省份对叶百部药材进行初步质量评价研究的基础上，以全国不同产地对叶百部为对象，对其总生物碱止咳机制进行研究；同时进行止咳药效研究，并运用中药化学、中药药理学和中药血清药物化学技术和方法，以HPLC-MS跟踪分析，对总生物碱及含药血清进行药物化学研究，建立HPLC指纹图谱，然后运用灰关联度等方法对谱效数据进行分析，研究对叶百部总生物碱止咳作用的谱效关系，找出对药效有贡献的"药效峰"，从而建立一种融化学分析与生物活性评价为一体的综合质量评价体系，揭示其止咳作用机制及其物质基础，为开发疗效确切、安全有效、质量可控的止咳新药提供实验基础，并为完善对叶百部质量标准提供科学依据。

本项目以前期对广西及周边地区对叶百部药材质量初步评价为基础，以全国不同产地对叶百部为对象，对其总生物碱止咳机制、谱效关系和血清药物化学进行研究，发现：（1）中枢性止咳机制可能是通过增加小鼠脑中5-HT、5-HIAA含量起到止咳作用；外周性止咳机制与其可减轻辣椒素抑制神经肽SP表达有关，可能与ATP-K+抑制剂对其止咳作用有关；通过病理切片HE染色观察，与模型组比较，气管和肺组织病理损伤明显减轻。（2）建立了对叶百部总生物碱HPLC指纹图谱，并分析与产地的相关性，结果显示31个产地分成3大类，每一类的样品相互间相似度均大于0.90；聚类分析结果与其产地的地理位置分布结果较为一致。采用灰色关联度分析方法对对叶百部总生物碱HPLC指纹图谱的8个共有峰峰面积与止咳作用进行相关性分析，发现各共有色谱峰与对叶百部总生物碱止咳药效均有不同程度的关联度，咳嗽次数关联度在0.8409～0.7549，抑咳率关联度在0.8174～0.7489，说明其止咳药效是有效组分群共同作用的结果，综合二个指标来看，其中1号峰（金刚大碱）、2号峰（异对叶百部新碱）、6号峰（氧代对叶百部碱）止咳药效关联度较强，推断它们在止咳药效中发挥了重要的作用。（3）通过对对叶百部总生物碱的血清药物化学研究发现，对叶百部总生物碱入血成分的代谢来源为新对叶百部碱开环衍生物和Ineotuberostemonol，这两种化学成分可能是对叶百部总生物碱止咳作用重要的物质基础。本研究初步揭示了其中枢性及外周性止咳作用机制及其物质基础，为开发疗效确切、安全有效、质量可控的止咳新药提供实验基础，并为完善对叶百部质量标准提供科学依据。. 另外，本项目组对一并采回的全国不同产地的对叶百部嫩叶应用ISSR和荧光AFLP分子标记技术进行遗传多样性研究，结果表明对叶百部具有较高的遗传多样性，其居群间亲缘关系与地理环境有一定的相关性。也对采样时采集到的同属药用植物细花百部进行显微鉴别和总生物碱含量测定研究，结果表明细花百部的显微特征明显，稳定、可靠，总生物碱含量在0.002～0.012mg/ml呈良好的线性关系。