DNA甲基转移酶3B异构体的研究

DNA 甲基转移酶3B（DNMT 3B）主要功能是DNA甲基化的从头合成，其在基因的特异表达，基因组印记，X染色体失活及癌症的发生有重要作用。DNMT3B 到目前为止至少有7种主要的异构体，人们虽然对DNMT3B做了大量研究，但对DNMT3B的异构体研究很少，其功能不详。据此，有必要对DNMT3B异构体的生物学功能和生化特性进行深入研究。本课题通过构建DNMT 3B1、2、3、4、5和7共6种异构体的真核和原核表达载体，用真核表达载体转染293A细胞并筛选稳定克隆，利用基因芯片技术、染色体免疫共沉淀、免疫组化和DNA甲基化检测等实验探明其在细胞内的作用，用原核表达载体转化大肠杆菌菌株Origami 2B ，通过IPTG诱导目的蛋白表达，用GSTrap纯化目的蛋白，利用EMSA和甲基化活性实验等实验探明其体外的生物化学功能。通过体内、外实验系统的探明DNMT3B异构体的生物学功能和生化特性。

我们成功构建了DNMT 3B1、2、3、4、5和7共6种异构体的真核(pCMV)和原核(pGEX-4T3)表达载体，同时我们也成功构建了DNMT3A1、DNMT3A2和BS69的真核和原核表达载体。利用DNMT 3B1、2、3、4、5和7共6种异构体的真核表达载体转染293A细胞并筛选稳定克隆。利用流式细胞仪技术、克隆形成实验、DNA甲基化检测和免疫组织化学化技术等实验探明DNMT 3B1、2、3、4、5和7共6种异构体在对细胞周期、克隆形成、整体甲基化的影响以及细胞中的定位方面都有差异。将DNMT 3B1、2、3、4、5和7原核表达载体以及DNMT3A和BS69原核表达载体转化大肠杆菌菌株Origami 2B ，通过IPTG诱导目的蛋白表达，用GSTrap纯化目的蛋白，分别得到利用DNMT 3B1、2、3、4、5和7和DNMT3A以及BS69的蛋白，利用甲基化活性实验实验探明DNMT 3B1、2、3、4、5和7的甲基转移酶活力有差异，这些异构体可以和DNMT3A 和BS69发生相互作用而改变其甲基转移酶的活力。 本研究通过体内、外实验系统的探明DNMT3B异构体的生物学功能和生化特性的差异。