基于小鼠与雪貂模型研究甲型H1N1流感病毒基因组多态性对致病性的影响及机制

The fact that the A(H1N1) influenza virus came again and led to multiple deaths around the world in the beginning of 2013 reminds us that the genetic mutations of this virus, which may generate some highly pathogenic strains, should always be vigilant and monitored. Searching for the critical sites which may affect pathogenicity in the virus genome could help us understanding the pathogenic mechanism and evolution pattern of this virus, and warning the potential pandemic of A(H1N1) influenza in the future. Based on these facts, the aim of this study is to explore the relationship between genomic polymorphism and viral pathogenicity of A(H1N1) influenza viruses. First, the pathogenicity of amounts of clinical A(H1N1) influenza viruses to BALB/c mice will be compared to distinguish some highly pathogenic strains. According to multiple genomic sequences alignment, some particular variations belonging to the highly pathogenic strains will be discovered. Second, these variations will be mutated separately to the residues corresponding to lowly pathogenic strains, and each recombinant virus will be packaged out by using reverse genetics technology. By using BALB/c mouse and ferret models, the relationship between these genetic variations and the virus pathogenicity will be evaluated. Finally, the mechanisms of how these variations affect virus pathogenicity will be investigated according to the function of proteins which the mutation sites are located.

2013年初再度来袭并导致全球多人死亡的甲型H1N1流感提醒我们应时刻警惕该病毒的基因变异情况，从而进化出极具危害的高致病性毒株。探寻甲型H1N1病毒基因组中影响致病性的关键位点，有助于加深我们对高致病性毒株的致病机制、危重症的成因、以及对甲型H1N1病毒分子进化规律的了解，并可用于提前预测可能再次发生的甲型H1N1疫情的潜在风险。有鉴于此，本项目拟探寻甲型H1N1流感病毒的基因组多态性对其致病性的影响。首先，基于小鼠模型及大量甲型H1N1临床标本，筛选出高致病性毒株，通过多重序列比对，找出导致其致病性显著增强的关键位点。然后将这些位点逐一回复突变为低致病性毒株所对应的残基，并利用反向遗传学技术包装出相应的重组病毒。随后使用小鼠与雪貂模型对该位点的变异与病毒致病性的相关性进行验证。最后，根据变异位点所在蛋白的功能，对其影响病毒致病性的机制进行深入研究与阐述。

探寻流感病毒基因组中影响致病性的关键位点，有助于加深我们对高致病性毒株的致病机制、危重症的成因、以及对流感病毒分子进化规律的了解，并可用于提前预测可能再次发生疫情的潜在风险。有鉴于此，本项目建立了多亚型流感病毒的小鼠及雪貂模型，以及标准化的模型评价技术规范。基于动物模型及临床表征各异的多株分离株，发现了5个与2009 pdm H1N1流感病毒致病性相关的氨基酸位点，并初步阐明病毒的受体结合亲和力的改变是影响其致病性的关键因素。在项目执行期间，2013年始于我国的人感染H7N9禽流感疫情给我国乃至世界造成严重的卫生、社会、及经济困扰，因此本项目在完成任务书计划目标及考核指标的前提下，将研究范围扩展到禽流感H7N9，及相关高致病性禽流感病毒，建立了H7N9的小鼠、猪、及雪貂模型，评价了H7N9对小鼠和雪貂的致病性，以及通过气溶胶的传播力，发现了8个与H7N9致病性相关的氨基酸位点。通过流行监测，于北京榆林燕和河北家鸭体内分别分离到禽流感H9N2及H10N8病毒，评价了H9N2病毒对鸡、小鼠、雪貂的致病性及通过气溶胶的传播力。通过构建H9N2病毒的鼠肺适应株，进一步发现了2个决定其致病性的关键氨基酸位点。同时，利用H7N9小鼠模型证实达菲与非诺贝特联合给药可显著提高感染H7N9禽流感小鼠的存活天数，为临床救治提供指导。进一步利用反向遗传学技术构建了重组H7N9病毒及H5N1 VLP疫苗，利用小鼠模型证实H7N9和H5N1禽流感病毒受体结合区决定宿主噬性的关键位点突变能显著影响重组疫苗对小鼠的保护效率，为针对哺乳动物的新型禽流感疫苗开发提供前期数据支撑。最后，本项目还研制了同时检测禽流感病毒H5N1和H7N9的Luminex多重液相芯片检测系统。项目执行期间共发表研究论文16篇，其中SCI论文6篇，核心期刊论文10篇，并申请及获批国内专利1项。