亚低温对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

Many researches focus on the protective of mild hypothermia in ischemia and reperfusion fields, but less in the field of organ transplantation. Our Previous studies suggested that mild hypothermia induced the expression of Cold-inducible RNA-binding protein (CIRP) in mice kidney, and CIRP enhanced the expression of proteins associated with antioxidant activity, which reduced the damages caused by ischemia and reperfusion. So, we speculate that down-regulating the body temperature to 32℃ in unstable haemodynamics donor may reduce the damages caused by ischemia and reperfusion, which may be mediated by the induced CIRP. We use HK-2 cells and rat kidney mild hypothermia models to validate our hypotheses. The cells and tissue specimen will be detected to reveal the mechanism of these protective effects.

临床应用亚低温（30℃-34℃）来保护重要器官缺血缺氧及再灌注损伤已有很多报道，但是在器官移植领域运用这一手段鲜有提及。我们前期的研究表明，亚低温能够显著增强小鼠肾脏中冷诱导RNA结合蛋白（CIRP）的表达，而CIRP的表达能够增加抗氧化活性功能相关蛋白的表达；上调CIRP的表达能够减轻缺血再灌注对组织的损伤。由此我们推测，在供体血流动力学不稳定之际将体温降至32℃左右能够增强供肾对缺血缺氧及再灌注的耐受力，这一过程可能与亚低温诱导表达的CIRP来有关。为了证实这个假设，本项目拟采用肾小管上皮细胞株和大鼠肾脏建立亚低温模型，观察亚低温对肾小管上皮细胞和大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用，进一步用分子生物方法阐明其保护作用的机制，为亚低温应用于器官移植领域提供一些理论支持。

在器官移植领域，缺血再灌注损伤已经成为了一个急需解决的问题。 特别是边缘性供体的使用增多，使得移植器官更容易遭受到缺血再灌注损伤。本研究中探讨亚低温对肝脏、肾脏缺血再灌注的保护作用，为亚低温应用于器官移植领域提供理论基础。我们的研究发现：亚低温组中ALT和AST平均值明显低于缺血再灌注组，肝细胞水肿程度明显低于缺血再灌注组。凋亡检测发现缺血再灌注组中凋亡细胞数量明显高于亚低温预处理组凋亡细胞数。肝脏中CIRP的表达于胞浆，亚低温2小时后逐渐升高。与IR+ pEGFP-C1组相比较，IR+pEGFP-C1-CIRP组AST、ALT、LDH均下降，细胞活力明显上升，SOD活性升高，MDA含量下降，差别均有统计学差异（p＜0.05）。NC组、IR组、MH+IR组的血清肌酐值分别为2.11±0.39 mg/dl、153.59±21.29 mg/dl、 87.44±13.81 mg/dl。与IR组相比较，MH+IR组肌酐下降，细胞凋亡比例亦明显减少，差别均具有显著的统计学意义（p<0.01），CIRP、TRX蛋白表达及Bcl-2/Bax比值明显升高（p<0.01）。MH+IR组SOD活性较IR组明显升高(26.90±4.41 U/mgprot vs 16.85±2.41 U/mgprot, p<0.01), MDA含量明显降低(0.76±0.18 nmol/mgprot vs 1.37±0.32 nmol/mgprot, p<0.01)。3’-RACE实验证实750bp和1000bp处两条带序列与NCBI报道的CIRP CDS有共同序列，可视为CIRP mRNA两条不同的剪接体，不同的刺激条件下，表达的剪接体并不相同。成功克隆出500bp与700bp 2条不同的剪切体命名为CIRP X1和CIRP X2，他们的主要差别在于X2在终止密码子前多了一个外显子序列。与正常对照组相比较，亚低温组蛋白表达增加1.5倍的有68种，降低1.5倍的有29种；在小鼠正常肝脏及缺血再灌注肝脏中，亚低温改变蛋白的表达，可能与亚低温的保护作用有关。本项目证实了亚低温对肝脏、肾脏缺血再灌注损伤的保护作用，并进一步用分子生物方法阐明其保护作用的机制，为亚低温应用于器官移植领域提供一些理论支持。