普洱茶发酵过程中高温菌与茶叶品质关系研究

Solid State fermentation is an important process to the quality formation of Pu-erh tea, and it is a typical high temperature fermentation process (the highest temperature was 70℃ in the center of fermentation tea piles). There are many kinds of thermopiles and play an important role in quality formation of Pu-erh tea during the Pu-erh tea fermentation. However, previous studies based on the pure culture could not completely reveal the community structure and change of thermopiles during Pu-erh tea fermentation. Moreover, the studies of essential enzymes related closely with quality formation of Pu-erh tea have not been carried out deeply. So in this project, the diversity of thermopiles during Pu-erh tea fermentation is plan to be analyzed using culture-independent approach combined with molecular biology technology. Construct a gene library, using substrate-induced gene-expression screening, essential enzymes genes will be screened and analyzed the functional structure. Development of the project, the community structure and diversity of thermopiles during Pu-erh tea fermentation process will be demonstrated at molecular level. Development of the project, essential enzymes genes will be screened and the structure of genes will be discovered. Furthermore, the mechanism on activity of thermopiles with Pu-erh tea will be preliminary discovered. These results can provide foundation for completely reveal the microbial community structure during Pu-erh tea fermentation, making the Pu-erh tea fermentation theory perfectly.

微生物固态发酵是普洱茶品质形成重要工序，其发酵过程是典型的高温发酵（茶堆中心最高温度可达70℃），存在多种高温微生物，但基于纯培养的研究未能完全揭示发酵系统中高温微生物的多样性，对普洱茶品质形成起关键作用的高温酶和高温优势菌也未进行深入研究。项目拟通过免培养法，采用分子生物学手段，开展普洱茶发酵过程高温菌多样性研究；构建基因文库，采用底物诱导基因表达筛选法，对普洱茶品质有重要影响的关键高温酶进行产酶基因筛选和功能基因研究；并以关键酶为核心，找出相关的产关键酶高温微生物，研究此类微生物的代谢规律及与普洱茶品质形成的关系。项目将在分子水平上探明普洱茶发酵过程中高温菌的种群和群落结构，明确产关键酶基因结构，阐释高温菌在普洱茶品质形成中的作用。预期成果将进一步探明普洱茶发酵系统中的微生物群落结构，揭示高温微生物及酶与普洱茶品质形成机制，完善普洱茶发酵理论。

普洱茶的发酵过程涉及到错综复杂的生物转化作用，微生物是这些生物转化的执行者，要想掌握普洱茶发酵机制、改进发酵工艺、稳定和提高普洱茶品质，就必需对微生物及其酶进行深入的研究。项目自2015年立项以来，应用分子生物组学技术开展了大量研究，取得成果如下：.（1）完成普洱茶发酵过程中高温菌多样性的研究。通过PCA主成分分析、PCoA主坐标分析和UPGMA聚类分析，发现真菌群落总体构成较为单一，子囊菌门、接合菌门基本占据主导地位；细菌群落总体构成多样性极强，变形菌门、厚壁菌门、蓝细菌门等相继占据优势地位。.（2）完成普洱茶发酵过程中高温菌代谢途径初探。萜类化合物和多酮类化合物及外源性物质生物降解代谢途径的代谢丰度分布分为在5%~7.5%。综合分析整体代谢途径，萜类化合物、多酮类化合物及外源性物质的代谢途径可能是形成普洱茶（熟茶）陈香的重要代谢途径。.（3）完成普洱茶高温发酵样优势高温菌种筛选及酶学性质研究。通过高通量测序获得部分功能基因的的基因数，以及代谢途径；通过传统培养方法分为三个温度梯度（45℃、55℃、65℃）筛选优势菌，并对筛选出的菌株进行纤维素酶及果胶酶的酶学性质测定，初步筛选出优势高温菌株。.（4）揭示产关键酶高温菌在普洱茶发酵过程中的发酵规律和代谢规律。针对目前普洱茶发酵系统中较少涉及的高温菌，通过免培养的方法采用分子生物学手段，对普洱茶品质形成有重要影响的高温多酚氧化酶及纤维素酶进行产酶基因的筛选和功能基因研究，在分子水平上明确产关键酶基因的高温菌，揭示产关键酶高温菌在普洱茶发酵过程中的发酵规律和代谢规律。.（5） 开展普洱茶固态发酵过程中高温菌免培养法及小型发酵研究，探明其代谢特性与茶叶品质形成的关系。利用小型发酵方式，接种特种高温菌，研究发酵过程中的品质特性变化。.项目研究探明了普洱茶发酵系统中较少涉及的高温菌的群落组成和动态变化，揭示了普洱茶不同发酵阶段的优势高温菌及其变化规律，明确了高温菌与普洱茶品质的关系，为云南普洱茶科学体系构建和产业的发展提供了理论依据。