HIF-1α通过直接调控ZEB1促进肠癌的EMT及侵袭转移能力

上皮-间质转变（EMT）是肿瘤侵袭与转移的标志性事件，其表型改变基于一系列转录因子的表达或胞内定位的改变。HIF-1是细胞适应低氧的重要转录调节因子，与结合元件HRE特异结合后，启动下游基因的转录表达。ZEB1是EMT核心因素，其高表达与肿瘤的恶性转移或不良预后有关。同时，在肾癌，ZEB1 mRNA表达与缺氧相关。本项目拟探讨HIF-1α和ZEB1促进肠癌EMT及侵袭转移的作用。将通过低氧培养或构建HIF-1α稳定表达株、siRNA干扰、qPCR、EMSA、ChIP、双荧光素酶检测和定点突变等方法，检测EMT指标变化；评价HIF-1α和ZEB1对肠癌细胞粘附、侵袭和转移的作用；探讨HIF-1α对ZEB1的直接调控作用及对转录活性的影响；评价HIF-1α和ZEB1对TGF-β诱导的EMT的作用；经脾或原位显微注射法构建动物转移瘤模型，体内验证上述作用与机制。完成后具有较大的理论与临床价值。

HIF-1a通过调控ZEB1促进肠癌EMT及侵袭转移能力.背景和目的：HIF-1a和KLF8是重要转录调节因子，其在肠癌细胞中高表达并参与调控肠癌细胞的迁移,但是具体的机制尚不明确，旨在明确HIF-1a和KLF8直接调控的靶基因及探讨其参与调控肠癌细胞侵袭和迁移的可能机制。方法：通过低氧培养或构建HIF-1α和KLF8稳定表达株、siRNA干扰、qPCR、EMSA、ChIP、双荧光素酶检测和定点突变等方法，构建老鼠原位转移瘤模型，调控肠癌细胞侵袭和转移的关键分子。结果：（一）HIF-1a对ZEB1在结肠癌中转录调控机制的研究:（1）DFO及Ad5-HIF-1a-EGFP处理细胞后，HIF-1a和蛋白表达水平显著增加，并引起细胞发生明形态学变化。对照细胞呈圆形且细胞间连接紧密，细胞极性良好；而DFO诱导、HIF-1a过表达的细胞呈梭形、成纤维细胞状。（2）Western证实缺氧或HIF-1a能够抑制E-cadherin和Plakoglobin、促进Vimentin和N-cadherin的表达，而诱导EMT的发生。(3)腺病毒感染体外体内能够显著增加肠癌细胞的粘侵袭和转移能力。（4）HIF-1a和ZEB1在肠癌组织中表达水平均显著高于邻近正常肠组织。（5）HIF-1a正性调控ZEB1的表达。EMSA结果发现，HIF-1a蛋白通过HRE3序列结合ZEB1启动子，双荧光素酶报告基因检测系统评价HIF-1a对ZEB1启动子转录活性的影响。（6）HIF-1a和ZEB1在原发肠癌和转移淋巴结呈阳性表达，HIF-1a、ZEB1和Vimentin在转移组织中的表达高于原发肠癌组织。（二）KLF8对FHL2在结肠癌中转录调控机制的研究:（1）Western证实KLF8过表达可促进Vimentin表达而抑制E-cadherin表达从而诱导EMT的发生。(2)免疫组化提示KLF8与FHL2在结肠癌组织细胞中的表达具有阳性相关性。(3)通过染色质免疫共沉淀实验证实KLF8与FHL2基因启动子直接结合。(4)在KLF8过表达细胞中压低FHL2的表达可以逆转EMT、增殖和转移模型。(5)体内实验证实FHL2参与调节KLF8诱导的EMT和侵袭转移。KLF8促进FHL2调节的增殖转移。结论：HIF-a和ZEB1、FHL2和KLF8的相互作用，在大肠癌EMT及侵袭转移中具有重要作用。