米糠中游离和结合态脂肪酶的分布、结构和活性的研究

In our country，the annual production of rice bran is high, but the utilization rate is extremely low, only 10% is used for further processing. Rice bran contains about 20% oil. Rice bran oil is rich in vitamin E, sterol, oryzanol and other nutriments which are good for our health. But the further processing of rice bran is impeded because of the rancidity caused by lipase. However, there is little research on the distribution and activity of rice bran lipase in rice grain. Therefore, this study is designed to explore the distribution of rice bran lipase in rice structure and bran structure by using staining techniques, laser confocal microscope and brown rice layered milling technology. Chromatography, column separation and electrophoretic technology were used to separate and purify the lipase according to the biochemical characteristics of different forms of lipase. The structures of different lipase were analyzed by using mass spectrometry and circular dichroism spectrum. Molecular simulation techniques and modification of amino acids in the active center were used to study the structures and activities of the different forms of lipase in order to know the catalytic mechanisms, influence factors of its activity which can be used to stabilize rice bran in an effective and low cost way.

我国每年米糠非常大，米糠含油约20%，米糠油富含维生素E、甾醇、谷维素等营养物质，营养价值极高。但米糠利用效率极低，仅10%进行深度加工，主要是米糠中脂肪酶快速使米糠酸败，米糠稳态化是米糠高值化利用的瓶颈技术。然而，人们对米糠脂肪酶在米粒中分布及其活性的研究甚少。因此本项目拟通过多种染色、激光共聚焦显微镜及糙米分层碾削技术探究米糠脂肪酶在米粒结构和糠中的分布；针对不同形态脂肪酶生化特点，采用层析、柱分离和电泳技术进行分离纯化，获得不同结合态的酶；利用质谱和圆二色谱等现代仪器分析技术表征不同结合态米糠脂肪酶的结构特点；通过分子模拟技术和活性中心氨基酸的修饰技术探讨不同结合态脂肪酶的催化活性中心的结构、活性，了解其催化机理和影响其活性的影响因素，为寻找钝化米糠脂肪酶的方法，探索绿色、快速、有效、低成本的米糠稳态化技术提供科学依据。

米糠占稻米总重的8%，但富含蛋白质、脂质、膳食纤维和谷维素、植物甾醇、维生素E、角鲨烯、多酚等植物化学物。米糠含油约20%，米糠中脂肪酶快速使米糠酸败，导致大部分米糠无法高值化利用。然而，人们对米糠脂肪酶在米粒中分布及其活性的研究甚少。通过稻米铣削技术将米糠从外到内分成四个等份，发现米糠的不同层次中营养成分分布存在显著的差异。脂肪酶活性从最外层到最内层表现出递减的趋势，油脂则主要分布在最外三层。采用层析、柱分离、电泳技术和液相质谱技术进行分离纯化，首次发现并鉴定其存在2种游离态脂肪酶，其氨基酸序列具有高度的同源性（97.78%），分子量分别为34928.23 Da和34071.18 Da。米糠脂肪酶在40 ℃ pH=7.5的时候具有最高的催化活性，在50 ℃以下和pH 7-7.5之间具有良好的稳定性。特定氨基酸位点的酶抑制剂苯甲基磺酰氟、焦炭酸二乙酯和胃蛋白酶抑制剂可以显著抑制脂肪酶的催化活性，表明米糠脂肪酶的活性位点是由Ser-His-Asp残基组成的三联体，并通过分子对接得到了证实。.米糠在被连续24 h提取内源性脂肪酶后，残渣仍有稳定的催化活性残留（26.68±3.69%），用3种物理方法（研磨法、匀浆法和超声破碎法）和6种酶处理方法（纤维素酶法、半纤维素酶法、果胶酶法、复合纤维素法、糖化酶法和α淀粉酶法）分别处理米糠，发现果胶酶处理后的上清液和残渣中脂肪酶活性均显著高于其他组，分别为437.63±22.54%和159.26±2.12%，说明米糠脂肪酶最有可能与果胶相结合。分子对接表明，果胶可以与两种米糠脂肪酶（lipase 315和lipase 308）相结合并掩盖脂肪酶的催化活性中心，可以阻碍活性中心与底物结合并抑制其催化活性。在结合态脂肪酶中，果胶可使脂肪酶更致密并降低其溶剂可及表面积，可降低脂肪酶分子间相互作用的能力。这是首次报道米糠中部分脂肪酶与果胶以结合态存在形式。此外该研究还探讨了影响脂肪酶活性的影响因素。结果为寻找绿色、快速、有效、低成本的米糠稳态化技术提供科学依据。