冷冻技术对人卵母细胞组蛋白乙酰化修饰的影响及分子机制的研究

Healthy oocyte plays key roles on female fertility. Cryopreservation of oocyte will injure the oocytes has been reported already. Among them, abnormal histone actylation will hamper nucleosome disassembly and delay DNA replication, thus it becomes a very important factor. While little is known about the molecular mechanism of the histone actylation’s modification and cryopreservation’s injury after human oocytes. Up to now, the effect of histone actylation on human oocytes’ cryopreservation remains unclear. In this research, we will firstly demonstrate the changes of histone actylation in human oocytes before and after cryopreservation, the effect of manual intervention by some acetylation enzymes further be confirmed. Continuesly, our research will focus on different express RNA before and after cryopreservation in human oocytes by microarray method and high-throughput sequencing. Afterwards globally map actylationed histone binding sites identify direct target genes and microRNAs in human oocytes. Subsequently, systematic bioinformatics analysis and relevant experiments will be conducted to decipher the detailed histone actylation molecular mechanisms and elucidate the histone actylation regulated signal pathways involved epigenetics. Collectively, through this study, we will initially clarify the effect of cryopreservation on histone actylation’s modification and molecular mechanism of cryopreservation injury. And furthermore, our results will be expected to show new light on the cryoprotectant’s development and cryopreservation technical improvement.

健康卵子是维持女性生育力的必要条件，目前冷冻技术对卵子造成的损伤已有些许报道，其中异常的组蛋白乙酰化水平因其阻滞卵子核小体的分解、延迟DNA复制，因此是重要影响因素。但至今冻融对于组蛋白乙酰化修饰的改变及卵子损伤的分子学机制仍所知甚少，尤其在人卵母细胞领域尚未见报道。本研究将首先利用免疫荧光证实组蛋白乙酰化在冻融前后的变化，并通过酶人工干预乙酰化水平进一步证实。接着用基因和microRNA高通量测序的方法筛选出差异表达基因，再在全基因组水平鉴定冻融前后卵子乙酰化组蛋白结合位点，明确组蛋白乙酰化直接调控的靶基因以及靶microRNA。并通过系统的生物信息学分析及相关实验来阐明冷冻技术通过改变组蛋白乙酰化水平损伤卵母细胞的分子机制，以及相关信号通路。通过本研究，我们将初步阐明冷冻技术通过组蛋白乙酰化修饰改变造成卵母细胞的表观遗传及发育潜能的影响，有望为冷冻保护剂和方法的研发提供新靶点和线索。

项目背景：.参考2013年美国生育年会（ASRM）颁布的指导原则表明，目前成熟卵子的冷冻已不再局限于实验研究。伴随着卵子冷冻技术在临床开展日益普遍。我们课题组在之前的研究中已经发现冷冻技术对卵子的纺锤体、染色质都造成一定损伤，ATP能量的损耗，有关凋亡的基因Bub1b、XIAP、BAX等改变，及孤雌激活后凋亡增加。从而推断冷冻技术对卵子以及胚胎的发育潜能都有负面效应。但造成纺锤体、染色质以及这些基因改变的机制尚未十分明确，这是本课题要深入研究的问题，并期待在干预调控后可减少冷冻技术的负面影响，为今后更安全的冷冻技术和冷冻保护剂的研究提供新靶点和新线索。.主要研究内容：.目前的研究发现组蛋白乙酰化对冷冻后的卵母细胞的成熟潜能有重要的作用。然而，之前的研究发现，在卵母细胞冷冻过程中组蛋白去乙酰化酶HDAC1和2起到关键作用。在我们的研究中发现，组蛋白乙酰化酶HDAC6也有重要的作用。我们用鼠卵母细胞做实验，低浓度的HDAC6水平降低冻融后的存活率，卵裂率和囊胚形成率。生物学分析，预测HDAC6目标基因microRNA的作用。用双荧光素酶报告的方法去验证和评估将miRNA结合到HDAC6 mRNA上的作用。在所有的HDAC6目标miRNA中，我们仅在鼠卵中发现miR-558,miR-527及miR-762。尤其，我们发现只有miR-762通过结合到HDAC6 mRNA的3’-UTR端显著抑制HDAC6的转化。.重要结果：.用HDAC6转染卵子或者抗血清miR-762从而增加HDAC6的浓度，来提高冻融后存活率、卵裂率和囊胚率。我们的研究证实了通过抑制miR-762来诱导HDAC6的水平可以改善卵母细胞冷冻的现状，提高效能。.关键数据：.Table 1: Relationship of HDAC6 levels and survival/developmental potential of cryopreserved oocytes..No. of oocytes.No. Survival (%).No. Two-cell (%).No. Blastocyst (%).HDAC6-high.100.98 (98).74 (74).69 (69).HDAC-low.100.93 (93).53 (53).40 (40).P value..0.043.<0.025.<0.033