皂角苷增强海水鱼类细菌疫苗浸泡免疫效果的作用机理

鱼类疫苗浸泡免疫为简捷的接种方式，但免疫保护率低阻碍浸泡疫苗的产业化进程。前期研究结果表明，皂角苷可显著提高大菱鲆细菌浸泡疫苗免疫保护率，具有佐剂活性，且在使用的有效浓度范围内对鱼体不表现毒性。为探讨皂角苷的佐剂效能机制，利用免疫组化、免疫电镜、ELISPOT免疫分析技术，研究皂角苷促进大菱鲆体表黏膜组织对抗原吸收的效果及对黏膜B细胞与抗体分泌细胞数量增殖的作用机制；利用RT-PCR技术，研究黏膜中免疫细胞内HMC IIα、IL-1β、TNF-α、TGF-β免疫调控因子的基因表达水平；采用免疫印迹法分析皂角苷对疫苗抗原活性的影响；应用激光共聚焦技术，分析皂角苷对血细胞及黏膜免疫细胞的损害程度，评价皂角苷对大菱鲆的毒性。阐明皂角苷提高浸泡疫苗免疫效果的机制,为高效鱼类浸泡疫苗的研制提供技术支撑。

鱼病防治技术中，免疫接种最为绿色高效，但不同的接种方法效果不同。采用浸泡疫苗免疫接种最为简单、对鱼损伤轻，但保护效果较注射差。研究显示皂角苷可提高大菱鲆浸泡疫苗免疫保护率，有佐剂活性。为探讨皂角苷的佐剂效能机制，课题根据项目研究内容开展了相应的工作。成果如下：研究确定了皂角苷的最佳佐剂浓度为45mg/L，在免疫后14d及28d的免疫保护率（RPS）分别可达(81.7±8.2)% 、(77.8±9.6.0)%，血清中抗体滴度峰值出现在免疫后14d；实时定量PCR分析IgM的表达结果显示，在皮肤和鳃中第4d可检测IgM mRNA转录水平上调，而在脾脏和头肾中上调峰值出现在第11d、14d；皂角苷佐剂联合灭活鳗弧菌疫苗免疫大菱鲆后，各主要免疫器官（皮肤、鳃、头肾、脾脏和肠组织）中各主要免疫相关基因在不同时间段内表达量出现相应上调。浸泡免疫中鳃丝、皮肤及肠道是相关基因表达的主要器官。鱼类皮肤中，MHCⅡα、IL-1β和TNF-α基因表达量最高的出现在鳃盖下方皮肤，其次是尾部侧线，腹面抗原呈递效果不明显；开展了异硫氰酸荧光素（FITC）标记细菌抗原的研究，确定了FITC的最适标记浓度范围为20g/mL～100g/mL，最适标记时间范围60min～120min，及适宜的存储条件；采用冷冻切片荧光显微观察技术，检测了鱼体黏膜组织对抗原的吸收效果，证明了大菱鲆鳃丝和鳃缘及侧线处皮肤是抗原呈递部位，高浓度（40mg/L）皂角苷能够增强体表对抗原的呈递作用，皂角苷浓度和浸泡时间与抗原呈递效果正相关。鱼体背面皮肤抗原提呈效果优于腹面，背面鳃缘处皮肤和侧线处皮肤抗原提呈效果优于他处；低浓度（15 mg/L）与高浓度（35 mg/L）皂角苷浸泡组大菱鲆后，白细胞吞噬活力分别在浸泡后12 h与24 h出现显著的增高。皂角苷浸泡鱼体后血清中补体旁路途径溶血活性得到提高。且高浓度皂角苷浸泡组大菱鲆血清中蛋白浓度得到提高；确定了皂角苷对红细胞溶血时间与皂角苷浓度呈对数负相关，皂角苷对大菱鲆白细胞也具有细胞裂解作用；皂角苷对大菱鲆的24h半致死浓度（24hLC50）为64.85mg/L；比较了其他疫苗佐剂DTT、黄芪多糖、葡聚糖对鳗弧菌及迟缓爱德华氏菌灭活疫苗的佐剂效果，确定了DTT最佳佐剂浓度为5mg/L，在免疫第15天时RPS可达71.4%。发现了黄芪多糖与葡聚糖均对迟缓爱德华氏菌疫苗具有佐剂