膜结合NAC转录因子LlNAC014调控百合耐热性的机理解析

Lily is an important flower in the world with high ornamental and economic value, but the high temperature in summer seriously affects the growth and quality of cut lily. Aiming at this problem, we have used a thermotolerant Lilium longiflorum cultivar 'White Heaven' as materials to obtain a transcriptional regulator LlNAC014 which can directly regulate the expression of L1HsfA3A by yeast one-hybrid screening. LlNAC014 belongs to a membrane-bound NAC transcription factor family and its function and regulatory pathway has not yet been elucidated under heat stress. In this project, we intend to analyze the protein evolution, protein biochemical activity and gene expression patterns of LlNAC014, and use transgenic technology to obtain overexpression plants to clarify the functions of LlNAC014; then yeast one-hybrid, dual-luciferase reporter analysis, gel-retardation experiments and chromatin immunoprecipitation technique will be used to confirm the direct regulation relationship between LlNAC014 and LlHsfA3A. The regulation mechanism of LlNAC014 and its downstream regulatory pathway will be identified by protein interaction analysis and RNA sequencing analysis. Finally, the molecular mechanism of LlNAC014 response to high temperature in lily will be elucidated, and out results will provide an important theoretical and practical basis for thermotolerance breeding of lily.

百合是世界上重要的花卉，观赏和经济价值极高，但夏季高温严重影响百合生长发育和切花品质。针对该问题，我们曾以耐热性较好的麝香百合（Lilium longiflorum）品种‘白天堂’为材料，通过酵母单杂交筛选得到了一个可以直接调控LlHsfA3A基因的转录调控因子LlNAC014，LlNAC014属于一个膜结合的NAC家族转录因子，其功能和调控途径还不明确。在本项目中，我们拟通过进化、生化活性及表达模式分析，并利用转基因技术获得过表达转基因植株，明确LlNAC014的基本功能；通过酵母单杂交、双荧光素酶报告分析、凝胶阻滞实验技术和染色质免疫共沉淀技术明确LlNAC014和LlHsfA3A的直接调控关系；通过蛋白互作分析和高通量测序分析明确LlNAC014的转录调控方式和下游的调控途径；最终阐明LlNAC014调控百合响应高温的分子机制，为百合耐热分子设计育种提供理论基础和优异基因储备。

NAC转录因子广泛参与植物的逆境胁迫调控，而其在百合耐热性中的研究鲜有报道。该研究发现LlNAC014是百合中一个膜结合的NAC家族转录因子，其基因在百合叶片中的表达受长期高温胁迫抑制，但高温可以迅速激活其蛋白功能。LlNAC014蛋白的C末端具有一个典型的跨膜结构域（TM）。在常温下，其定位于膜系统上，但在高温条件中，LlNAC014发生蛋白加工形成定位于细胞核的活性形式蛋白LlNAC14ΔC。LlNAC14ΔC在其C端具有转录激活结构域，可以在酵母和植物细胞中发挥转录激活子的作用。在百合和拟南芥中过表达LlNAC014ΔC可增加其耐热性，但在百合中沉默LlNAC014会降低耐热性。基因表达分析表明LlNAC014ΔC可以通过诱导依赖于或不依赖于热激转录因子（HSF）途径的高温响应基因的表达来组成型地激活热激反应。进一步地研究表明，LlNAC014是DREB2-HSFA3耐热核心模块的直接调节因子，其活性形式LlNAC14ΔC可直接与LlHSFA3A、LlHSFA3B和LlDREB2B启动子中的CTT（N7）AAG元件结合以激活其表达。因此，该研究发现LlNAC014通过感受高温胁迫发生蛋白加工后转移至细胞核中以激活DREB2-HSFA3模块来提高植物的耐热性。该研究通过解析 LlNAC014在百合高温响应中的调控机理，为培育耐热的百合种质提供了有效的基因储备和良好的理论基础。