基于转录组学和多肽组学技术的华蟾素注射液肽类分子的生物学活性研究

Cinobufacini injection, an aqueous extract from the skin of toad Bufobufogargarizans Cantor, is mainly used to treat various tumorin China.The content of protein-like components accounted for more than 50% of injection’s solids weight. These componentsshowed equal antitumor activities on different tumor cellscompared with the injection and raised much attention by investigators. However, the origin and the primary structures of the protein-like components, as well as the structure characterizedand activity specific peptides and the mechanisms of their action need to be investigated. Proteome and peptidome of the skin of Bufobufogargarizans Cantor were determined based on the assembly of the toad skin transcriptome. Our results indicated that the peptides widely existed in the cinobufacini injection. As many as 70 peptides and 127 proteinprecursorswere identified in the cinobufacini injection. Three out of the 70 peptides showed obvious inhibitory activities on tested tumor cells. Based on our foundings, this project will carry out systematically investigation onthe protein-like components contained in the cinobufacini injection. To reveal the natural property of peptides and evaluate their contribution to the drug efficacy and the adverse reactions by biological activity assays, such as anti-tumor, analgesic and sensitization activities. The proposed project will provide new method and ideafor the investigation of protein/peptide molecules intraditional Chinese medicine(TCM)injections, promote the modernization and internationalization of TCM industry.

华蟾素注射液是由中华大蟾蜍皮肤精制得到的主要用于肿瘤治疗的中药注射剂，其含有的多肽成分占注射液固形物50%以上，这些多肽的抗肿瘤、镇痛等作用引起关注。然而，华蟾素注射液中肽类分子的来源与结构、具有特定生物活性的单体分子及其作用机制等许多重要问题有待研究。我们在中华大蟾蜍皮肤转录组测定的基础上，对华蟾素注射液蛋白质组和多肽组进行了测定，结果显示大分子的肽类物质广泛存在于注射液中。70种小肽以及来自127种蛋白质前体的多肽存在于注射液中，其中的3个小肽分子对肝癌、乳腺癌细胞有显著的抑制作用。本项目立足于前期工作，开展华蟾素注射液中肽类物质的系统研究，明确华蟾素注射液中小肽分子的所有结构，结合抗肿瘤、镇痛和致敏等生物学活性测定，进而阐明具有特定生物学功能小肽分子对华蟾素注射液疗效的贡献和对不良反应的影响。项目实施将为中药注射剂中蛋白质/肽类分子的研究提供新的方法和思路，促进中药现代化和国际化。

中药注射剂是传统医药理论与现代生产工艺相结合的产物，是中药现代化的重要产物。但是，由于对大多数中药注射剂的有效成分和其安全性研究不足，如果通过静脉注射，绕过了肠胃屏障，直接进入血液，必然存在安全隐患。在中药注射剂成分研究中，对动物来源药品中的肽类分子研究较少，成为了中药注射剂行业健康发展需要面对的重要核心问题。本项目以华蟾素注射液为研究对象，对华蟾素的来源中华大蟾蜍进行了皮肤及其毒液的组学分析，与此同时对7个不同批次华蟾素注射液开展了多肽蛋白组学分析，在华蟾素注射液中共鉴定到120余条多肽分子。根据其氨基酸序列，采用化学合成法合成，经高效液相色谱法检测，其纯度大于95%，再经质谱进一步确定。进而分别开展抗肿瘤活性筛选及镇痛活性筛选实验，我们发现多肽CI9对人肝癌细胞Bel-7402具有明显抑制效果且对人正常肝细胞无明显毒性，而多肽CI5、CI118在醋酸扭体、热板疼痛模型以及炎性痛模型-福尔马林模型上镇痛效果显著。同时，进行了安全性研究，发现具有致炎活性多肽：CI68、CI100。本项目为华蟾素应用于更多临床适应症以及提高治疗安全性提供新思路，科学诠释存在于华蟾素注射液中不同肽类分子的生物学功能，明确特定肽类分子对药物疗效的贡献以及在药物不良反应中的作用。此将深入加强我们对华蟾素注射液的认识，以避免药物不良反应的产生。相关的研究结果将有助于中药注射液中蛋白质/肽类物质的研究，为中药注射液生产厂家提高药品质量提供科学的依据，提升中药现代化和国际化。