中华大蟾蜍皮肤分泌物中拮抗内毒素的抗菌肽分离及其构效关系研究

抗菌肽除了具有抗菌活性外，尚有拮抗内毒素(LPS)能力。然而目前从两栖动物中提取的抗菌肽，主要以抑菌为目的进行分离。本项目拟从中华大蟾蜍皮肤分泌物中分离出拮抗LPS活性优良的抗菌肽，并明确其拮抗内毒素构效关系。据此，我们将采用强免疫刺激物-LPS刺激中华大蟾蜍后，收集其皮肤分泌物，通过凝胶色谱、高效液相色谱分离技术，结合鲎试剂法测定，筛选出能拮抗LPS活性优良的抗菌肽。并以此为基础，通过小鼠巨噬细胞LPS刺激实验和小鼠内毒素休克模型实验，进一步确定抗菌肽拮抗LPS的能力。最后通过分析抗菌肽与LPS反应动力学参数、抗菌肽与LPS结合的三维结构以及LPS与抗菌肽二级结构的结合状态，明确抗菌肽拮抗LPS的构效关系，探讨抗菌肽组成、结构对拮抗LPS活性的影响，为抗菌肽拮抗LPS的研究奠定基础。

为了高效分离中华大蟾蜍皮肤中抗菌肽，本项目运用转录组和多肽分离相结合技术，确定抗菌肽种类与序列。通过项目实施，完成中华大蟾蜍皮肤转录组深度测序，获得大约4.65G数据，通过组装和拼接，得到75229个unigenes。通过BLASTX比对，在NR数据库中，31271个unigenes标注 (占41.6%)；在NT数据库中，26170个unigenes标注 (占34.8%)；在Swiss-Prot数据库中，28079个unigenes标注 (占37.3%)；在KEGG数据库中，22943个unigenes标注 (占30.5%)；在COG数据库中， 9658个unigenes标注 (占12.8%)；在GO数据库中， 20814个unigenes标注 (占27.7%)。在中华大蟾蜍转录组测序的基础上，结合生物信息学手段，发现2个Cathelicidin抗菌肽家族基因，并预测出6个抗菌肽序列。在抑菌试验中，BG-CATH（5-37）对嗜水单胞菌效果最明显(MIC=12.5ug/ml) 。小鼠巨噬细胞RAW 264.7 LPS刺激实验中，BG-LW18可以降低IL-6水平，BG-CATH(5-37)能够降低TNF-α水平。6个抗菌肽都具有低的溶血活性。同时，将抗菌肽应用于体内，减缓降解，增加生物利用度，成功构建了携载OH-CATH30纳米粒缓释体系。中华大蟾蜍皮肤中抗菌肽研究的开展，为抗菌、免疫调节、拮抗内毒素等方面药物的开发提供了的先导分子，同时对中华大蟾蜍皮作为一味重要中药使用提供了有益指导。