参知健脑方对血管性痴呆大鼠clathrin介导的NMDA受体胞吞过程的作用机制研究

The pathogenesis and treatment of vascular dementia (VD) is the difficulty and focus of industry. Chinese medicine has effect of anti-aging and Vascular sclerosis, but the mechanism is not clear. The latest foreign study found that clathrin was the most significant reduced synapse-associated protein in VD patients brain, which mediated N-methyl-D-aspartic acid (NMDA) receptor endocytosis. The over load of NMDA receptor could increase the excitatory amino acid toxicity of glutamate, ultimately leading to neuronal apoptosis. By the support of National Major New Drug Development Program of Ministry of Science the efficacy study has already Verified Shen Zhi Jian Nao formula has the effect of repairing of neuron injury rat model of VD, which was under the theory of “ZhengXuDuSun”. This research will establish ischemia and reperfusion VD rats model and glutamate damaged hippocampal neurons VD cell model, using NMDA receptor antagonist memantine as a control group, using immunocytochemistry, immunohistochemistry, RT-PCR and western blotting experiments technique to detect the change of NMDA-NR1, clathrin and its markers Rab5b in rat brain tissue and cell models. To study on the influence of Shen Zhi Jian Nao formula on clathrin-mediated NMDA endocytosis and its dynamic changes at different time points. Provide scientific evidence of a new target for medical treatment of VD.

血管性痴呆(VD)的治疗是业界攻克的难点，中医药确有疗效，但作用机制尚不明晰。国外最新研究发现网格蛋白Clathrin是VD患者脑内降低最显著的突触相关蛋白，其介导的神经元N甲基D天冬氨酸（NMDA）受体胞吞减少使兴奋性氨基酸毒性大大增强，最终导致神经元凋亡。在“正虚毒损络阻”理论指导下的参知健脑方，已完成临床前研究，初步发现其对VD大鼠模型的神经元损伤有修复作用。本课题拟分别建立缺血再灌注VD大鼠模型和体外培养谷氨酸损伤海马神经元VD细胞模型，采用行为学、免疫学和分子生物学技术，检测VD大鼠模型脑组织以及细胞模型中clathrin以及其标记物Rab5b和NMDA等表达分布变化，并以NMDA 受体拮抗剂美金刚作为对照组，从整体、组织、细胞和蛋白分子水平，验证参知健脑方对clathrin介导的NMDA受体胞吞过程和不同时点动态变化有调节作用的假设，为中医药治疗VD提供崭新科学依据。

血管性痴呆(VD)的治疗是业界攻克的难点，中医药确有疗效，但作用机制尚不明晰。网格蛋白Clathrin是VD患者脑内降低最显著的突触相关蛋白，其介导的神经元N甲基D天冬氨酸(NMDA)受体胞吞减少使兴奋性氨基酸毒性大大增强，引发神经元凋亡，可能是VD发生的重要发病机制。本项目构建了反复缺血再灌注VD大鼠模型，给予参知健脑方干预治疗，观察其对clathrin介导的NMDA受体胞吞过程和不同时点动态变化的调节作用；体外谷氨酸诱导PC12细胞损伤，构建VD细胞模型，给予参知健脑方干预并观察其对NMDA受体胞吞关键指标变化的影响；运用网络药理学的方法，对参知健脑方的药效机制进行整体及系统性的探索。行为学检测评估参知健脑方对VD大鼠认知功能的影响，HE及尼氏染色评估VD大鼠海马组织的病理学改变，CCK-8法及IncuCyte实时成像系统检测PC12细胞形态变化及增殖和毒性情况，流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况，高内涵分析系统检测细胞游离钙离子及活性氧水平，Western blot、qRT-PCR、免疫组织化学法及细胞免疫荧光染色法检测海马组织及PC12细胞中相关蛋白与基因的表达水平。. 成功复制VD大鼠模型，参知健脑方能够改善VD大鼠的学习记忆和认知功能，修复海马CA1区神经元的排列及形态等病理学改变，减少神经元的损伤和丢失，增加神经元数量。参知健脑方能够上调海马组织clathrin和RAB5B的表达，下调神经元膜表面NMDAR1的表达，并对NMDAR1不同时点的表达变化有调节作用，促进NMDAR1的内吞，进而减轻兴奋性毒性损伤，发挥脑保护作用。参知健脑方有效改善体外VD细胞模型的谷氨酸毒性损伤，改善细胞活力，修复细胞周期，抑制细胞凋亡、减轻钙离子超载及活性氧损伤，上调clathrin和RAB5B的表达，下调NMDAR1的表达，可能与促进clathrin介导的NMDA受体胞吞过程有关。网络药理学结果显示，参知健脑方共含有18个入血活性成分及154个潜在治病靶点，关键靶点涉及INS、ALB、AKT1、CASP3等，主要涉及MAPK、HIF-1和凋亡等信号通路。. 本项目探讨了参知健脑方治疗血管性痴呆的药效机制，丰富中医药在VD治疗中的科学内涵，为其临床推广应用提供崭新科学依据。