UBE3A通过调控磷酸化TRAF2参与CGA抑制心肌肥大的作用机制研究

Cardiac hypertrophy is a chronic and progressive interstitial myocardial disease. In our previous study, we found that CGA could effectively inhibit cardiac hypertrophy induced by isoproterenol (Iso), reduce the level of intracellular ROS, prevent NF-κB from entering into nucleus, and blocks the activation of NF–κB and other proteins related inflammatory signaling pathways. Further study found that TRAF2 and UBE3A were both involved in the reaction process，but its functional mechanism is still unknown. This project intends to do some further study as follows. Firstly, the relevances among UBE3A, TRAF2 phosphorylation and cardiac hypertrophy will be investigated during CGA treatments or the changes of UBE3A. Secondly, the formation of proteasomes in cardiomyocytes will be blocked by MG132, and then we will study the regulatory mechanism of p-TRAF2 in the process of cardiac hypertrophy. Finally, based on the technique of PCR site-directed mutagenesis, we will reveal the roles of UBE3A regulating TRAF2 via inactivation of ubiquitin catalytic center. The goal of this study is to clarify the molecular mechanism of CGA inhibit cardiac hypertrophy by suppressing the activation of phosphorylated TRAF2 related inflammatory signaling pathways. It will also provide theoretical basis for the treatment of cardiac hypertrophy with TRAF2 as a new target.

心肌肥大是一种常见的慢性致死性心肌损伤疾病。本课题组前期研究发现绿原酸（CGA）能够有效地抑制异丙肾上腺素（Iso）诱导的心肌肥大，降低细胞内的氧自由基水平，抑制NF-kB向细胞核内转运，阻断NF-kB及其他炎症相关通路蛋白的激活。我们进一步筛选发现TRAF2和UBE3A基因可能参与该反应过程，但具体机理不明。本项目拟深入研究：1.在CGA预保护作用下，利用腺病毒和siRNA强制调控UBE3A，探讨UBE3A、TRAF2及其磷酸化与心肌肥大病程的相关性。2.通过MG132抑制蛋白酶复合体形成，分析磷酸化TRAF2在心肌肥大调控中的作用机制。3.借助碱基定点突变技术，使UBE3A催化泛素化功能失活，阐明其调控TRAF2的分子机制。该研究以期阐明CGA抑制磷酸化TRAF2激活炎症反应通路，进而阻断心肌肥大发生的分子机制，为以TRAF2为靶点治疗心肌肥大提供理论依据。

该项目是在利用细胞生物学方法对筛选出的30多种中药成分的基础上，证明绿原酸（CGA）的预处理能够显著地抑制异丙肾上腺素（Iso）诱导的心肌肥大，旨在研究CGA对心肌肥大有效抑制作用的分子机制，阐明CGA的治病机理，推动中医药的发展。. 课题组首先通过分离纯化心肌细胞研究了Iso和CGA对UBE3A、TRAF2表达量和磷酸化程度的变化，结果显示CGA的预保护能够阻断Iso导致的UBE3A、TRAF2表达，但是TRAF2的磷酸化水平仍然上调。通过蛋白芯片GSEA分析发现Iso刺激导致的心肌细胞肥大过程中hippo-YAP信号通路显著变化，推测TRAF2磷酸化变化很有可能与该通路相关，进一步的研究结果将会新的论文中发表。Ube3a的敲低会导致TRAF2及其磷酸化表达上调，同时也会加剧Iso诱导心肌肥大的效果。CGA对Ube3a沉默心肌细胞的预保护作用仍然能够抑制Iso的刺激作用。说明Ube3a的沉默能够导致细胞内蛋白质合成与降解的失衡，但不会造成疾病的发生。同时蛋白芯片表达谱也显示Ube3a的敲低会引起包括Traf2在内很多基因表达的上调。随着分子生物学技术这两年来的快速发展，动物水平上采用主动脉缩窄手术（TAC）造心肌肥大小鼠模型，通过RNA-seq转录组测序和DIA-MS蛋白质检测等高通量技术，发现CGA对心肌肥大的保护作用跟免疫系统的调控相关性很强，信息学分析同时显示这个病理调控过程与凝血和溶血机制也相关。课题也从高通量表达数据中筛选出了一些可能的心肌肥大预测的分子标记物，并逐一进行了分子生物学验证，申请了三项发明专利。. 本课题解释了CGA抑制Iso诱导心肌肥大的分子机制，发现了心肌肥大筛查和诊断的分子生物学标记物，同时也梳理出了治疗压力性心肌肥大治疗靶点，为心肌肥大临床诊断和治疗药物的开发提供了科学的应用方向。