工程控制策略有效解除大肠杆菌培养过程中乙酸抑制机理探索

大肠杆菌由于其在生产过程中的成本优势，仍然是首选的用于工业及医药重组蛋白的生产菌，但是常常出现高密度培养下的低蛋白表达现象。影响外源蛋白高表达的关键问题之一是乙酸的积累，为实现重组大肠杆菌的高密度培养和高表达,必须解除乙酸抑制。本研究拟通过改变发酵控制策略（如改变剪切力、脉冲强度、频率、压力等），检测过程中的工程、热、动力学参数、细胞内蛋白含量和活性、渗透压、乙酸浓度等数据，找到大肠杆菌的生理生化特性（如外膜蛋白活性、含量等）与工程参数改变、乙酸形成之间的关系，解释工程控制策略改变引起的培养过程中乙酸抑制现象发生的机理，其目的在于从工程调控角度方便地解除乙酸抑制，不仅可以充实现有解除乙酸抑制理论体系，解决高密度发酵与低蛋白表达的矛盾，而且可以在不改变菌株特性仅通过工程控制和环境因子的改变实现高密度培养和蛋白的高表达，降低成本、快速、有效地指导工程菌发酵。

本项目通过改变发酵控制策略（如改变剪切力、脉冲强度、频率、压力等），检测发酵过程中的工程、热动力学参数、细胞内蛋白含量和活性、渗透压、乙酸浓度等数据，试图对大肠杆菌的生理生化特性与工程参数改变及乙酸形成进行关联，阐释工程控制策略改变引起的培养过程中乙酸抑制现象发生的机理。结果表明：.1）在诱导前脉冲补料阶段，脉冲补料对细胞干重的影响较为明显。此阶段葡萄糖浓度控制在一个较低的范围内（0.5-2 g/L），同时乙酸积累量也较低（低于0.5 g/L），这表明，不论发酵液中葡萄糖存在与否，乙酸均能够作为碳源提供菌体生长所需的营养和能量；OUR和CER的变化幅度也表明此阶段能够排除由于细胞摄取率不足而造成乙酸分泌的可能因素；质粒稳定性的实验结果说明在诱导前补料阶段葡萄糖属于限制性基质，为细胞提供一个合适的“饥饿”时间，有利于带质粒细胞的繁殖，而不利于不带质粒细胞的生长。.2) 在诱导后脉冲补料阶段，脉冲补料对细胞干重的影响不太明显。加入大量葡萄糖后，葡萄糖浓度仍处于相对较低的范围之内，这表明这些葡萄糖被用于合成目标产物。此阶段外源蛋白的表达降低了宿主细胞的生理活性和葡萄糖的摄入速率，从而导致了乙酸浓度的降低。此阶段OUR、CER和RQ的变化幅度较诱导前补料阶段有所降低，说明外源蛋白表达使得细胞摄氧率降低，并导致乙酸不断积累。在HLC表达方面，R8模式下蛋白表达量最高(7.26 g/L)。.3）重组E. coli BL 21高密度发酵过程中，增加罐压是一种行之有效的增加供氧、促进细胞生长和产物表达的操作方式，而且加压过程中CO2溶解度的增加并没有对E. coli BL21菌株造成不利影响，这说明了此菌株具有一定的CO2耐受性。在发酵的最后阶段，补料量逐渐超过细胞生长的需求，细胞的比生长速率变得很低。此时，发酵进入一个不可控阶段，葡萄糖开始积累，细胞的质粒丢失率达到了最大值19%，因此应该将此时作为发酵过程的终点。通过对加压操作方式的研究和动力学模型的建立，为重组E. coli的控制工艺优化和放大提供了一定的理论和实践的指导意义。