可穿膜重组TAT-tCNTF对阿尔茨海默病的作用机制研究

阿尔茨海默病(AD)是一种慢性进行性致命性神经变性疾病，β淀粉样蛋白(Aβ)在脑中逐渐聚集是发病主要原因。我们前期研究发现睫状神经营养因子(CNTF)体外可促进神经细胞分化、抑制Aβ聚集，但CNTF是蛋白质大分子，很难透过血脑屏障，无法发挥在中枢的作用。故采用分子克隆技术获得目的融合蛋白TAT-tCNTF，前期预试验显示该蛋白能够改善AD模型小鼠的学习记忆功能，因此本研究拟通过体外双室双层细胞培养模型研究融合蛋白对Aβ生成转运聚积过程的动态干预作用，并在两种AD动物模型上观察融合蛋白在脑内参与Aβ转运和清除的分子机制，并进一步进行神经元特异表达蛋白的检测，从神经元再生角度，以期阐明TAT-tCNTF对学习记忆的影响机制，从而解释其对AD的作用机理。该研究的实施可明确TAT-tCNTF抑制Aβ聚集和诱导神经元再生改善学习记忆的分子机制，为AD治疗提供新的解决方案，为中枢疾病研究治疗提供思路。

Aβ沉积形成淀粉样斑块及神经元退化是AD的主要病理特征和始动因素，而CNTF显著减少Aβ聚集同时CNTF促进多种细胞的生长，故CNTF具有治疗AD的良好前景。但CNTF很难透过血脑屏障（BBB），限制了其临床应用。人类免疫缺陷病毒HIV-1的反式激活蛋白（TAT）能携带外源性大分子转运至细胞内。故本课题将TAT和截短式（truncated）的CNTF基因重组表达并获得了TAT-tCNTF融合蛋白的可溶性表达。同时考察了融合蛋白的透膜机制和对Aβ损伤小鼠的作用机制。. 在体外TAT-tCNTF穿过细胞膜和BBB模型，并且TAT-tCNTF的跨膜效应受巨胞饮抑制剂影响。经体内实验验证，经腹腔注射的TAT-tCNTF穿过BBB入脑，在海马区的分布明显高于rhCNTF。另外还发现TAT-tCNTF可提高细胞内谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）活性。TAT-tCNTF缓解Aβ对可传代的SH-SY5Y细胞和原代的海马神经元的生长抑制和早期凋亡。. 机制研究发现：TAT-tCNTF减少侧脑室注射Aβ小鼠脑内的淀粉样沉淀。TAT-tCNTF改善Aβ损伤小鼠的空间学习记忆能力。TAT-tCNTF减少Aβ在海马区的淀粉样沉积。TAT-tCNTF增加海马区的神经元增殖，说明TAT-tCNTF促进Aβ损伤小鼠的神经元再生。TAT-tCNTF缓解由Aβ引起的神经细胞胶质化。TAT-tCNTF降低Aβ前体蛋白（APP）的蛋白表达量，并减少tau蛋白的过度磷酸化，同时激活Akt和ERK通路，说明TAT-tCNTF与其CNTFαR结合发生级联效应，对Aβ损伤小鼠的病理和表型有所改善。. 本课题将难透膜的CNTF经基因重组构建表达出可穿膜的TAT-tCNTF融合蛋白，解决了CNTF不能在临床广泛应用的难题，为TAT-tCNTF的临床应用提供依据并为AD的治疗提供良好的前景。