脑靶向输送新型神经营养因子MANF的磁性纳米载体构建及其在帕金森病治疗中的应用

Novel neurotrophic factors CDNF/MANF have received considerable attentions for their specific protection of dopaminergic neurons. However, they hardly enter the brain due to the presence of blood brain barrier (BBB), which decreases the therapeutic effects of Parkinson's disease (PD) significantly. Therefore, it has great importance to construct a targeted nanocarrier for brain delivery of NTFs. To construct such targeted delivery system, the self-made magnetic mesoporous Fe3O4@mSiO2 nanoparticles are employed as the carrier, the common ligand lactoferrin (Lf) of the BBB and PD lesion site is selected as the targeting molecule and NTFs are encapsulated in the Lf-modified nanoparticles. In vitro toxicity of the nanocarrier will be carried on the b.End3 cell lines by using MTT assay and the intracellular uptake will be examined by using CLSM and FACS analysis. Before the in vivo experiment, NTFs are loaded into the nanopores of the mesoporous layer on the surface of the nanocarrier. Then MANF-His protein delivered to the brain is verified by double immunofluorescence staining method. Finaly, the therapeutic effects of the nano carrier system are investigated on the built PD rat model via the behavioral test, the neuron surviral/apoptosis analysis, and striatal transmitter content detection.

新型神经营养因子家族的CDNF/MANF因能特异性保护多巴胺能神经元而倍受关注，但由于血脑屏障（BBB）的存在难以通过外周给药到达脑内，从而影响了其在帕金森病中的应用。因此，构建具有靶向功能的纳米载体，对实现MANF在脑内的成功转输具有重要意义。本项目拟以磁性/介孔Fe3O4@mSiO2纳米粒子作为载体，利用纳米粒子表面的介孔SiO2层实现对重组人MANF-His的包载；选择BBB和病灶组织高表达的乳铁蛋白受体（LfR）的配体Lf作为靶向分子，使其穿越BBB后在病灶部位富集；通过检测小鼠脑毛细管内皮细胞b.End3的活性和增殖情况来评价纳米载体的毒性；通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜等研究细胞摄取及胞内定位；用免疫荧光双标法鉴定被输送到脑内的MANF-His；在大鼠帕金森模型上，通过检测行为学、神经元存活/凋亡、神经递质等来考察该载药系统递送的MANF对帕金森病的治疗作用。

新型神经营养因子MANF对多巴胺能神经元有特异性保护作用，可以有效缓解脑缺血等神经性疾病引起的神经元凋亡，近年来已成为研究热点。然而血脑屏障（BBB）的存在难以通过外周给药到达脑内，从而影响了其在脑卒中等脑部疾病中的应用。因此，构建具有靶向功能的纳米载体，对实现MANF在脑内的成功输运具有重要意义。本项目以磁性Fe3O4纳米粒子作为载体材料对重组人MANF-His蛋白进行负载；选择血脑屏障中血管内皮细胞表面高表达的乳铁蛋白受体（LfR）的配体乳铁蛋白（Lf）作为靶向分子，使其穿越BBB后在病灶部位富集。分别在细胞核动物水平上评价了其生物相容性及其疗效。具体如下：.1.采用溶剂热法制备了油酸包裹的氧化铁纳米粒子，表面通过双羧基PEG修饰得到表面含有羧基的PEG修饰的超顺磁性Fe3O4纳米粒子。然后通过EDC/NHS法在Fe3O4纳米粒子表面偶联上脑靶向分子乳铁蛋白Lf。TEM表征结果显示粒子经Lf偶联后表面裹有一层蛋白分子，通过动态光散射对粒径的分析表明经Lf修饰后粒径增大，FT-IR结果也证实了Lf的成功连接。.2.选取人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞为脑缺血再灌注损伤为细胞模型分别采用MTT法和PI染色法评价了Fe3O4纳米粒子和Lf修饰的Fe3O4纳米粒子的毒性，结果显示两种纳米粒子对细胞均无明显毒性。.3.采用线栓法建立大鼠脑缺血再关注损伤模型，采用尾静脉注射的方式将载有MANF的纳米给药系统注射至老鼠体内，组织学HE染色结果显示该纳米给药系统对大鼠主要器官无明显影响，同时磁共振扫描结果和普鲁士蓝染色结果证实经Lf修饰的Fe3O4纳米粒子能有效到达脑缺血损伤的大鼠脑部，为靶向输送功能性MANF蛋白提供了有效方法。