β-内酰胺类抗生素工业发酵的信号转导调控研究

以青霉素和头孢菌素为代表的β-内酰胺类抗生素因其高效、低毒已成为临床应用最广泛发展最快的一类抗生素。尽管在稳定可控培养条件下（如恒化培养）青霉素生物合成途径在基因和生化水平上都已得到了良好的表征，但实际工业发酵生产过程中，发酵过程波动和不均匀的细胞微环境直接对真菌细胞的生长及生产造成影响。本项目针对工业发酵过程中β-内酰胺类抗生素生物合成基因调控机制问题，以细胞蛋白翻译后修饰为切入点，用高通量定量蛋白组分析方法和结合细胞信号转导研究手段，研究工业发酵过程中β-内酰胺抗生素生物合成途径中蛋白质翻译后修饰，寻找其工业生产过程中调控的关键信号事件和信号分子，揭示β-内酰胺抗生素生物合成调控机制及其与工业环境相互间作用关系，提出青霉素等β-内酰胺抗生素工业发酵过程的信号转导生产调控模型。本申请将为青霉素和头孢菌素生产工艺改进提供科学依据，对于理论改进青霉菌和头孢菌素生产菌株具有极其重要的意义。

β-内酰胺类抗生素因其高效、低毒已成为临床应用最广泛发展最快的一类抗生素。虽然在稳定可控培养条件下青霉素生物合成途径在基因和生化水平上都已得到了良好的表征，但实际工业发酵生产过程中，发酵过程波动和不均匀的细胞微环境直接对真菌细胞的生长及生产造成影响。本项目用高通量定量蛋白组分析方法和结合细胞信号转导研究手段，探索蛋白质水平与工程环境因子和抗生素生产间关系；探究细胞蛋白信息流变化与产物间的基本规律；寻找调控生产的关键信号事件和途径，寻找青霉素等抗生素生物合成相关的调节因子和调节方式，研究表明: . 发现在中试过程中156个蛋白和工业过程中151个蛋白差异表达，参与糖酵解、糖异生、三羧酸循环、ATP生物合成过程、细胞的氧化还原等过程。发现15个蛋白质斑点与青霉素合成紧密相关，共10不同分子量和等电点的蛋白斑点都是异青霉素合成酶（IPNS）。中试和工业发酵的胞外培养液中，中试（12个蛋白）和工业过程（13个蛋白）参与细胞的氧化还原；在胞外培养液中均检测到直接参与青霉素的生物合成的IPN-acyltransferase和IPNS。. 发现磷酸酯酶C抑制剂对菌体生长影响较小，但对青霉素生产和积累影响显著，前体物及磷酸酯酶C抑制剂主要影响青霉素生物合成的发酵前期和中期；钙离子通道抑制剂利心平对青霉素生产无显著影响，而钙离子通道抑制剂氯化钴和钙离子螯合剂EGTA降低得青霉素产量。获得潜在生物标记物（尿酸、丙二酸等）代谢物与青霉素生产呈现正相关性。. 不同接种密度引起的利迪链霉菌中差异表达蛋白质参与了细胞的多个代谢过程，参与碳代谢的PfkA2、GatB等在高接种密度中表达水平明显上升，与谷氨酸合成相关酶的水平下降。随着接种密度的提高，细胞内的氨基酸水平呈下降趋势；获得与利迪链菌素生物合成密切相关的8种潜在生物标志物的变化规律。胞外氧化还原状态影响目标代谢合成，溶氧水平改变2，3-丁二醇得率和产率，转速降低导致NADH/NAD+比值的提高，适宜转速获得最优得率和产率， Vc添加提高产量和产率和NADH/NAD+比值改变。 . 这些研究结果可以高通量地发现与青霉素等抗生素合成密切相关的蛋白水平的差异表达蛋白，为进一步改造青霉菌等代谢路径和构建高产菌株提供了靶点，为获得提高青霉素等抗生素的产量提供一定的理论，也为其他工业抗生素菌株的改造提供新的方法和思路。