microRNA在根结线虫寄生发育中的调控网络研究

根结线虫是世界上为害最严重的线虫种群之一，对花生、蔬菜生产造成巨大损失。microRNAs(miRNA)是一类普遍存在于真核生物中的重要调控因子，其本身及其靶标基因均具作为药物靶标潜力。本项目基于根结线虫小片段RNA深度测序及其全基因组序列，利用生物信息学方法从基因组水平上发掘根结线虫miRNA，用Northern杂交和qRT-PCR方法鉴定与根结线虫寄生发育相关的miRNA，在此基础上结合根结线虫全基因组基因注释结果和EST数据，预测miRNA调控的靶基因，构建根结线虫miRNA在寄生发育中的调控网络，以miRNA为锚定引物进行RT-PCR，克隆与鉴定重要靶基因并研究其时空表达模式和作用方式，探索miRNA在调控根结线虫寄生发育过程中的作用机理，为解析根结线虫致病机理提供理论依据，为抗根结线虫分子育种提供新的转基因靶标。

基于第二代测序技术solexa对南方根结线虫毒性突变体与野生型的microRNA组进行高通量测序，从全基因组层面上对其毒性突变体遗传变异进行解析，主要结果为：.1）.共预测出101个microRNA基因，经mature miRNA序列去冗余后得到73个非冗余miRNAs，其中34个能在其他线虫中找到同源基因，其他的为南方根结线虫新的microRNA基因。.2）.一些microRNA基因成簇分布，mir-71/mir-2和let-7/mir-100在A. suum, B. malayi等线虫中成簇分布，成簇分布特征具有高度保守性，说明这些microRNA基因在功能上可能具有某种相似或关联性。但同一基因簇内的不同microRNA基因表达量并不具有相关性，如mir-71与mir-2的表达量相差很大，mir-71的表达量明显较mir-2高。.3）.mir-100/let-7基因簇在多个物种中保守，包括人和果蝇，但在模式线虫C. elegans和P. pacificus中mir-100基因可能在进化过程中丢失了，其行使的功能可能由其他microRNA基因代替。.4）.piRNA在C. elegans中是一类称之为21U的小RNA，通常情况是以U开始、长度为21 bp的小RNA，C. elegans具2个Piwi基因，prg-1和prg-2，但南方根结线虫Ago蛋白家族缺少Piwi子家族成员，缺少该子家族的还有A. suum，说明piRNA发生途径可能在这些线虫中缺失了，缺少piRNA可能与南方根结线虫严格孤雌生殖现象有关。.5）.南方根结线虫两个毒性变异种群与野生型在microRNA种类上没有差异，未发现SNP, INDEL等遗传变异，绝大部分microRNA在表达量上无明显差异。但miR-993在Mi-1毒性变异种群中的表达量明显高于野生型，而miR-81a, miR-240分别在Me3、Mi-1毒性变异种群中表达量明显低于野生型。