猪miR-155转录调控规律及其两种单倍型差异表达分子机制研究

A great deal of research has confirmed that miR-155 play crucial roles in immune system and disease resistance. QTL studies showed that there were multiple immune capacity, blood parameters and disease resistance QTL in porcine miR-155. We identified two different haplotypes of miR-155 in Chinese and foreign pig breeds, some blood parameters between the haplotypes are significant difference in pigs, such as, white blood cell counts, lymphocyte number and so on. The crucial SNP in different haplotypes of Chinese and foreign pigs affected the expression of miR-155, which led to the difference in the proportion of immune cells, which may be an important reason for the differences in the disease resistance between Chinese and foreign pigs. In this study, the transcription regulation pattern of porcine miR-155 will be validated through dual luciferase reporter assay system and EMSA system, critical SNP in the haplotype which affect the transcription of miR-155 will be found. Meanwhile, differences in resistance to Salmonella infection between the two haplotypes of miR-155 in pigs will be investigated. The results could reveal the mechanism of transcriptional regulation of porcine miR-155, identify the key SNP sites of miR-155 transcription, explore its role in the resistance of bacterial infection, and also provide important molecular maker for pig resistance breeding.

大量研究证实miR-155在机体免疫、抗病调节中发挥重要作用，同时QTL研究表明猪miR-155位置存在多个免疫及抗病相关QTL。申请人前期研究发现中外猪种中miR-155存在完全不同的两种单倍型（包含5个完全连锁突变），且不同单倍型与猪白细胞、淋巴细胞等多个血液参数关联。这可能是中外猪种不同单倍型中的关键SNP影响了miR-155的表达，导致免疫细胞比例差异，造成中外猪种抗病力差异的一个重要原因。因此本研究拟采用双荧光素酶报告基因系统、EMSA等方法系统研究猪miR-155转录调控规律，鉴定单倍型中影响miR-155表达的关键SNP位点及其对表达水平的影响，同时比较miR-155两种单倍型猪对沙门氏菌感染抵抗力的差异。研究结果将从理论上揭示猪miR-155转录调控机理，鉴定影响miR-155表达的关键SNP位点，同时探索其在抵抗细菌感染中的作用，为猪抗病育种提供重要分子标记。

大量研究证实miR-155是一个抗病相关的重要调节基因，前期研究发现中外猪种中miR-155存在完全不同的两种单倍型（包含5个完全连锁突变），且不同单倍型与猪白细胞、淋巴细胞等多个血液参数关联。推测是中外猪种不同单倍型中的关键SNP影响了miR-155的表达，导致中外猪种的抗病力存在差异。本研究筛选出猪miR-155基因启动子活性区域，并鉴定miR-155重要转录因子Foxp3，EMSA结果表明Foxp3蛋白与AA型探针的结合能力高于CC型探针（A/C突变为5个完全连锁突变的第一个突变位点），揭示猪 miR-155 转录调控规律。分两种策略采用CRISPR/Cas9系统构建miR-155敲除的猪肺泡巨噬细胞系（3D4/21），为miR-155的功能研究提供细胞模型。以两种单倍型AA和CC为基础，构建系列突变载体M1-M7，采用Northern blot和RT-qPCR方法检测miR-155的表达量，结果发现CC型miR-155的表达量显著高于AA型，且位于5个完全连锁突变的第4个突变位点（G/T）能显著影响miR-155的表达量。RNA的二级结构分析发现这些SNPs，特别是第4个突变位点（G/T）显著改变miR-155的二级结构，推测这些SNPs可能通过引起miR-155的二级结构的改变从而影响成熟miR-155的表达及功能。以上研究结果从理论上揭示猪miR-155转录调控机理，鉴定影响miR-155表达的关键SNP位点，为猪抗病育种提供潜在的重要分子标记。