文心兰microRNA及其靶向的抗性基因在印度梨形孢诱导的系统性抗性中的调控机制

Pififormspore indica, a model fungus to study symbiotic root interactions, is able to colonize in a wide range of host plant including orchids and brought broad-spectrum induced systemic resistance(ISR).Presently, the mechanism of the ISR brought by this fungus is not very clear. Priviously, we established databases of miRNA and transcriptome in root of Oncidium colonized by P.indica, we found a batch of miRNAs were predicted to target different type of NBS-LRR genes,and their expression profiles were corresponded to the symbiotic process. Based on the previous results, this study will mine the NBS-LRR genes in transcriptome,analyze the miRNAs predicted to target these NBS-LRR genes ; Using fluorescent marker section to study the symbiotic process in different treatment; quantitative PCR to analyse the expression pattern of miRNA and their target during symbiotic process and pathogen infection after colonization, predict the mediating mechanism and physical function of these genes in symbiotic process and ISR,follow by verify the physical function by transfer assays. These results will help us to understand the mediating mechanism and physical function of miRNAs and their targets in symbiotic process and ISR brought by P.indica, also help to understand the mechanism of the formation of induced systemic resistance in plant colonized by symbiotic fungus.

印度梨形孢菌可寄生于包括兰科植物在内的多种植物根部并带来广谱的系统诱导性抗性(ISR)，是研究植物根际共生的模式菌株，目前，其独特的ISR形成与作用机制是研究热点之一。此前，我们已建立接种印度梨形孢文心兰根部的miRNA与转录组数据，并发现一群miRNA预测靶向不同类型NBS－LRR抗性基因，表达量响应共生进程。本项目拟在此基础上，通过发掘文心兰转录组中的NBS－LRR基因,分析靶向NBS-LRR基因的miRNA；利用荧光标记切片观察不同条件下共生进程; 荧光定量PCR分析候选miRNA及靶基因NBS-LRR在共生进程及共生后病原物侵染下表达规律，筛选miRNA-NBS-LRR关键节点，并通过遗传转化实验进行验证。研究成果将为解析miRNA及其靶向的NBS-LRR基因在印度梨形孢诱导的ISR作用中的调控机理及生理功能提供依据，并为了解植物与菌共生过程中ISR的作用机制提供参考。

文心兰易受软腐病影响，特别是菊欧文氏杆菌所诱导的软腐病具有破坏性大、漫延快的特点，目前，还未发现包括兰科植物在内的抗性品种，对该病的抗病机理研究将为兰科植物抗软腐病及抗病育种提供科学依据。. 印度梨形孢可在文心兰中产生对菊欧文氏杆菌的系统诱导性抗性，并且印度梨形孢在平板中不直接抑制菊欧文氏杆菌的生长，ELISA测试表明，包括水杨酸、茉莉酸、乙烯均可以在接种印度梨形孢与菊欧文氏杆菌后被系统性地诱导，表明印度梨形孢可能诱导文心兰内在抗性基因与防御表达。项目利用HMM-SEARCH在文心兰获得99条具有NBS-LRR特征抗性基因，并预测到相应的46条，18个家庭miRNA调控基因。荧光定量PCR表明，文心兰抗性基因基本不响应菊欧文氏杆菌，但响应印度梨形孢的接种，而对应的miRNA表现相反趋势，可为外源水杨酸和菊欧文氏杆菌所诱导。同时，印度梨形孢对抗性基因的诱导表达模式可以为外源茉莉酸甲脂所模拟。表明水杨酸、茉莉酸信号途径可能在印度梨形孢的ISR过程中扮演重要作用，特别是印度梨形孢所诱导的对抗软腐病相关基因应与茉莉酸信号途径密切相关。为了进一步了解ISR过程中文心兰基因网络的表达调控机理，目前已完成6组ISR过程中转录组测序。此外，已克隆获得7条抗性基因全长，导入文心兰进行基因功能验证研究。. 印度梨形孢所诱导的ISR模式为兰科内在基因调控对抗菊欧文氏软腐病提供了一个优秀的平台。印度梨形孢可能通过提高JA并调控NBS-LRR基因上调表达提高植株对软腐病的抗性，菊软文氏杆菌则可能通过提高内源SA水平，并倾向于诱导相应miRNA基因上调表达，帮助其完成病程侵染。对该ISR模式的进一步深入研究将为兰科乃至其他植物的抗软腐病育种提供新的科学依据。