罗汉果中催化葫芦二烯醇到罗汉果醇的CYP450基因功能研究

Mogrosides, the cucurbitane-type triterpene saponins, have mogrol as the common precursor. Until now, the biosynthetic pathway from cucurbitadienol to mogrol has been unknown, which involves cytochrome P450. In this study, we focus on functional study of CYP450 genes involved in mogrosides biosynthesis and found the ones catalyzing cucurbitadienol into mogrol through full-length gene cloning and heterelogous expression. Some candidate CYP450s were screened after comprehensive analysis of transcriptome sequencing and chemical compounds content detecting, and gene functions were further identified by VIGS, yeast expression and enzymatic reaction in vitro. Finally, goal CYP450s were transformed into engineering yeast with high yield of cucurbitadienol and deeply confirmed in vivo. If we can successfully identify the CYP450s responsible for mogrol, we will elucidate the mogrosides biosynthetic pathway better, and provide solid foundation for target genetic breeding and full-scale production of mogrosides.

罗汉果甜苷是一类葫芦烷型四环三萜类化合物，其共有的苷元前体为罗汉果醇，目前从环化骨架葫芦二烯醇到罗汉果醇的生物合成尚不明晰。这一过程涉及到羟基化反应的细胞色素P450酶，本项目拟围绕罗汉果甜苷生物合成途径中CYP450基因的功能展开研究，通过克隆全长基因，在酵母中异源表达，找到能够催化葫芦二烯醇羟基化的CYP450基因。本项目在转录组结合化学成分含量联合分析下，找到候选CYP450基因，经荧光定量测定基因表达量来验证表达谱的准确性，利用VIGS手段、酵母表达、体外酶促反应来挖掘参与罗汉果醇生成的CYP450基因，明确其功能，最后将具有目的功能的CYP450转入高产葫芦二烯醇的底盘菌中进行体内功能验证。通过分析筛选和功能研究获得目的CYP450基因，首先能够确定罗汉果醇如何生成，进而能够更深入地完善罗汉果甜苷生物合成途径，最终为定向遗传育种以及大规模生产罗汉果甜苷奠定扎实基础。

罗汉果中的主要活性成分和甜味成分是葫芦烷型四环三萜类物质-罗汉果甜苷，其环化骨架葫芦二烯醇如何进一步修饰到苷元母核罗汉果醇的生物合成步骤尚不清晰。这一修饰过程涉及到羟基化反应的细胞色素P450酶的参与，本研究集中围绕罗汉果甜苷生物合成途径中CYP450基因的功能展开，具体内容包括中间产物的化学含量检测、转录组数据分析筛选候选CYP450基因、基因全长克隆、荧光定量PCR检测候选基因的表达量、酵母载体构建、表达及产物检测，以及CYP450基因的伴侣分子NADPH-细胞色素P450还原酶（CPR）基因的克隆、表达及功能研究。本研究最终获得32条CYP450基因的全长序列，分别成功构建了酵母表达载体，在酵母中验证功能，发现SgCYP16可以催化葫芦二烯醇生成11-羟基-葫芦二烯醇和11-羰基-葫芦二烯醇，并且SgCYP16在罗汉果中的表达规律与关键酶基因二烯醇合酶基因一致，表明SgCYP450极有可能参与了罗汉果醇的生物合成；表达有SgASO的酵母菌株中可以检测到1个产物峰，但是化学结构尚无法定性。本研究的罗汉果果实、叶片和根中未检测到中间体成分11-羟基-葫芦二烯醇、11-羰基-葫芦二烯醇和罗汉果醇，表明这些中间体不能在罗汉果体内大量积累，极有可能瞬间转化为下游的甜苷等成分。本研究进一步筛选并获得2条CPR基因，通过异源表达发现，二者均具有NADPH-细胞色素P450还原酶的功能。研究结果能够为罗汉果醇的生物合成提供科学依据，并能为后续的合成生物学提高甜苷产量奠定基础，提供基因资源，同时为植物三萜生物合成途径中CYP450基因的功能研究提供借鉴。