来源于放线多孢菌的CRISPR/Cas系统的分析及功能鉴定

Due to CRISPR/Cas system possess the characters of targeted cutting DNA molecules, it is used for targeted genetic modification. The system exists in Bacteria and Archaea widely, but it has not been reported in Actinomycetes. Actinopolyspora xinjiangensis TRM4013 was isolated from lop nur, it is a novel species. After analysis of the whole genome sequence, the results showed that it has 13 CRISPR/Cas sites, it has innovation to research the CRISPR/Cas system from Actinopolyspora xinjiangensis. In this project we will use the TRM40136 strains as the research material, research the diversity and phylogenetic analysis of the Actinomycetes CRISPR/Cas, reveals the specificity of CRISPRs in Actinomycetes. By means of molecular biology, we will construct the CRISPR/Cas system from Actinomycetes in E. coli, then apply the TetR genes to identify the function of CRISPR/Cas system, TetR gene is the negative regulation factor of Actinomycetes. Then screen the CRISPR/Cas system, which can cut TetR nucleic acid. It is the first report of CRISPR/Cas system in Actinomycetes to implement this project. This research provides the basic data of the evolution and function mechanism about the Actinomycetes CRISPRs. It established the theoretical base for building activation model of the gene cluster in Actinomycets.

CRISPR/Cas系统对DNA分子具有靶向切割活性，可以被用于定向的基因修饰，它在细菌、古菌中广泛存在，但在放线菌中还未见报道。对来自罗布泊的新物种新疆放线多孢菌TRM40136进行全基因组测序分析表明，其中蕴藏着13个CRISPR/Cas 位点，因此研究放线多孢菌中的CRISPR/Cas具有首创性。本项目以TRM40136菌株为研究材料，对放线菌CRISPR/Cas进行多样性及系统进化分析，揭示放线多孢菌中CRISPRs的特异性。通过分子生物学手段在大肠杆菌中构建来自于放线多孢菌的CRISPR/Cas系统，以放线菌中广泛存在的抗生素合成基因的负调控基因TetR为靶标，筛选能够切割TetR基因的CRISPR/Cas系统，这一工作的实施首次建立来自于放线菌的CRISPR/ Cas基因修饰系统，为构建放线菌基因簇的激活模型奠定理论基础。

成簇的规律间隔的短回文重复序列( clustered regularly interspaced short palindromic repeats，简称为CRISPR)，是一种最新的基因修饰技术。基于其间隔序列具有多态性，故 CRISPRs可以作为细菌的分型标准。本研究通过对放线多孢菌属和糖霉菌属全基因组序列的扫描分析，发现在放线菌中含有丰富的CRISPR位点，因此分析放线多孢菌的CRISPRs不但具有首创性，而且还能够丰富其对物种进化的功能，为放线菌CRISPR的演化及功能机制研究提供了基础数据。.基于放线菌菌株的全基因组序列及数据库中已报道的放线菌全基因组序列为基础，以CRISPRdb (CRISPR database) 中已报道的原核微生物中已鉴定的CRISPRs为对照，利用CRISPR Finder软件预测放线菌全基因组序列中的CRISPRs，并对CRISPRs进行系统分析，包括Leader序列、repeat序列、插入片段序列（spacer）和cas基因。通过分析发现放线多孢菌属的CRISPR/Cas系统主要属于Ⅰ-E型与Ⅰ-C型，糖霉菌属的CRISPR/Cas系统主要包括I-E和I-A两种类型，部分菌株中存在着III类型的系统。.CRISPR可以使细菌获得对噬菌体、质粒等外源DNA侵染的免疫机制，而CRISPR结构中的间隔在免疫机制中发挥着重要作用。因此，本研究主要通过从新疆土壤环境中分离得到噬菌体，对分离的噬菌体进行生理特性的研究，可直观的了解该噬菌体部分重要特性，指导后续放线菌CRISPR/Cas系统对外源DNA（噬菌体或质粒）免疫机制的研究，从而揭示CRISPR的功能。.CRISPR/Cas系统的作用机制主要是由 CRISPR转录加工形成的crRNA，通过与Cas功能蛋白形成复合物，特异识别和消除入侵细胞的外源质粒或病毒，能够在CRISPR的介导下定向切割靶标外源核酸从而对基因起到修饰的作用，是一种最新的基因修饰技术具有远大的前景。糖霉菌具有作为新疆典型盐环境的优势放线菌物种，以基因组为背景发现糖霉菌中蕴含着丰富的次级代谢产物基因簇，具有很高的活性潜力，且糖霉菌中具有丰富的CRISPR/Cas系统，与菌株的遗传适应性有密切关系，为了深入研究和开发糖霉菌的活性，同时研究该菌株CRISPR/Cas的遗传适应性，本研究以基因组为基础，通过生物信息学分析，