海带硝酸盐还原酶基因表达与酶活的调控机制

The nitrogen is not only the important substance in plant tissue structure, but also the most active and ubiquitous element as the main component of the enzyme in physiological metabolism, playing a significant role in nitrogen metabolism in plant life. An important way by which plants incorporate nitrogen to their metabolism is the assimilation of nitrate, which should reduce nitrate to nitrite, converted to ammonia and further incorporated into amino acids and protein. In this study we would firstly clone and characterize of the nitrate reductase gene in Saccharina japonica. Its roles and position would be revealed by phylogenetic analysis. Secondlly, the nitrate uptake rate, tissue nitrogen concentration, nitrate reductase activity and nr expression under different stress conditions would be determined respectively. The correlationship between gene expression, nitrate reductase activity, and relative physiological parameters will be defined. The respondence of nr expression and NR activity to primary environmental factors and their modulation mechanism will be analyzed. Finally, the daily rhythm of nr expression relative to different photoperiod was determined and analyzed to check whether it was endogenous controlled. This study will illustrate the molecular mechanism of nitrogen metabolism in marine brown macroalga. Moreover, it will provide the effective reference to assessment the macroalgal capacity of bioremediation and acclimatization.

氮素既是组成植物有机体最重要的元素之一，又是其生理代谢中生物催化剂的主要组分，其代谢对植物生命活动至关重要。硝酸盐还原酶NR是植物氮素同化的关键酶，催化体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，形成氨基酸和蛋白质后参与有机体构成。项目以海带为研究对象，获取其nr基因的全长序列，通过系统发生分析推测其在进化过程中的地位；分别测定不同处理条件下海带配子体、幼孢子体及成熟孢子体NO3-吸收效率、组织氮含量、nr基因表达水平和酶的催化活性，明确基因表达、酶催化活性与各生理指标的相关性，分析海带NR基因表达与催化活性对主要环境因子的响应及调控机制；检测nr基因在光周期下的昼夜表达模式，明确nr基因表达是否具有内源节律性。项目有助于揭示大型海洋褐藻氮素代谢途径的分子调控机制，为正确评估海洋藻类环境修复潜力以及揭示海洋生物的适应能力和调节机制提供理论基础。

氮素既是组成植物有机体最重要的元素之一，又是其生理代谢中生物催化剂的主要组分，其代谢对植物生命活动至关重要。硝酸盐还原酶NR是植物氮素同化的关键酶。本项目以海带为研究对象，以氮素代谢关键酶-硝酸盐还原酶NR为核心，在获取其基因全长序列的基础上，采用实验生态学、分子生物学实验技术手段，揭示不同环境条件下海带氮素代谢调控机制。本研究执行情况良好，基本按照计划进行，内容无大的调整和变动。本研究首先在海带转录组及基因组测序数据库中，获取2452bp硝酸盐还原酶基因序列，涵盖目标基因全长序列。与模式生物水云（Ectocarpus siliculosus）的同源基因相似度为86%。进化树分析结果显示目标基因与水云聚在一起。然后，采用配子体克隆繁育技术及筏式养殖技术，获取不同世代（配子体、孢子体）海带实验样品，设置不同环境处理条件，结果显示，随着底物培养基中硝酸盐浓度的升高，硝酸盐还原酶活性NRA显著增强，表明底物对NR具有刺激作用；NRA在N/P为10时达到最大值；不同N源条件下，N-NO3对NRA有正向促进作用，而N-NH4对NRA有抑制作用；在高温25℃及高光1000 μmol m-2 s-1条件下，NRA呈不规则波动变化。相比正常培养条件，高光（HL）、高温（HT）、高盐（HS）和酸化（OA）处理下，硝酸盐还原酶基因nr表达显著上调，而在低盐条件下，nr表达水平下降。在此基础上，模拟全球气候变化，开展温度变化和海洋酸化对海带硝酸盐还原酶（NRA）和谷氨酰胺合成酶（GSA）活力的单独影响和耦合影响。温度实验结果表明，NRA在15℃时达到最大值，GSA在20℃时达到最大值。酸化实验表明NRA在1000 μatm时达到最大值，GSA在700 μatm时达到最大值。而温度和酸化的耦合作用结果则因实验条件的不同呈现出不同的相互作用机制。本研究将为揭示大型褐藻应对全球气候变化调控机制提供理论参考依据，为进一步预测其在全球生物地球化学循环中角色改变及对贡献力提供数据支持。