TRIM21通过调控PD-L1表达对非小细胞肺癌的放疗增敏作用及其机制研究

Radioresistance is a major cause that restricts therapeutic efficacy in non-small cell lung cancer (NSCLC). The activation of PD-1/PD-L1 pathway could cause tumor cells to escape the host immune response, thus, resulting in radioresistance. Our previous researches have shown that PD-L1 expression was increased in NSCLC radiosensitive cell lines after conventionally fractionated radiation and the expression of PD-L1 was correlated with radioresistance. We further found that E3 ubiquitin ligase TRIM21 can directly bind with PD-L1 by using immunoprecipitation and mass spectrometry. Up-regulating TRIM21 revealed a negative regulation of PD-L1 expression in protein-level and resulted in an improvement in radiosensitivity in NSCLC cell lines. We speculated that TRIM21 can promote PD-L1 protein degradation via ubiquitination and enhance radiosensitivity via releasing immunosuppression. In the current project, we will use plasmids construction and endogenous co-immunoprecipitation to define the binding area of TRIM21 and PD-L1, clarifying that TIRM21 can indeed regulate PD-L1 expression via ubiquitination. We will further explore the potential mechanism of TRIM21-induced radiosensitivity via regulating PD-L1 expression in mice model with lung cancer, hoping providing new insight in PD-L1 regulating mechanism, as well as enhancing radiosensitivity.

NSCLC的放疗抵抗是制约其疗效提高的主要因素。PD-1/PD-L1信号通路激活可使肿瘤细胞发生免疫逃逸，导致放疗抵抗。我们前期研究发现：常规分割放疗可导致NSCLC放疗敏感细胞株PD-L1表达上调，且PD-L1上调与放疗抵抗相关。我们利用免疫沉淀结合质谱分析进一步发现E3泛素连接酶TRIM21可与PD-L1直接结合。上调TRIM21后可在蛋白水平对PD-L1存在负调控作用，并可增加NSCLC细胞的放疗敏感性。我们推测TRIM21可能通过其泛素化作用促进PD-L1降解，解除免疫抑制，增加放疗敏感性。本研究拟利用质粒构建及内源性免疫共沉淀技术进一步明确TRIM21与PD-L1的相互结合区域，阐明TRIM21的确可通过泛素化作用调控PD-L1表达，并将在小鼠肺癌模型中深入探讨TRIM21通过调节PD-L1发挥放疗增敏作用的机制，以期为PD-L1的调控机制提供新视角，为增加放疗敏感性提供新思路。

NSCLC的放疗抵抗是制约其疗效提高的主要因素。PD-1/PD-L1信号通路激活可使肿瘤细胞发生免疫逃逸，导致放疗抵抗。我们的研究发现：常规分割放疗可导致NSCLC放疗敏感细胞株PD-L1表达上调，且PD-L1上调与放疗抵抗相关。免疫沉淀结合质谱分析发现E3泛素连接酶TRIM21可与PD-L1直接结合。TRIM21和PD-L1在NSCLC放疗敏感细胞株和放疗抵抗细胞株中的蛋白表达呈负相关，调节TRIM21表达可引起PD-L1蛋白表达水平发生变化，但对PD-L1 mRNA无显著性影响，提示TRIM21可在蛋白水平调控PD-L1的表达。过表达TRIM21后NSCLC细胞株接受放疗后存活分数下降，增加了放疗敏感性；小鼠模型中进一步证实过表达TRIM21可增加放疗敏感性，与放疗产生协同抗肿瘤效应。进一步在小鼠模型中对TRIM21增加放疗敏感性的机制进行探索，通过流式细胞术分析了CD8+ T cells、Tregs、TAMs、DCs、B cells、NK cells的变化情况。结果发现：在过表达TRIM21联合放疗的小鼠组中，CD8+ T cells显著上升、而免疫负性调节细胞包括Tregs和TAMs显著减少。TRIM21对DCs、B cells以及NK cells未见明显影响，提示：TRIM21可能通过增加CD8+ T cells的浸润、减少免疫负性调节细胞包括Tregs和TAMs，改变肿瘤微环境，从而发挥放疗增敏作用。最后我们收集了37例不可手术的III期NSCLC患者放疗前的活检标本，对其TRIM21和PD-L1进行了IHC染色，结果发现TRIM21高表达患者的比例为21.6%，PD-L1阳性率为67.6%。进一步分析发现：TRIM21与PD-L1表达存在负相关（p=0.08）。进一步对TRIM21和PD-L1与患者放疗后的PFS进行分析后发现：TRIM21高表达患者的PFS较低表达患者延长（11.3对比8.6个月，p=0.06），而PD-L1阴性患者的PFS也优于PD-L1阳性患者，但未见统计学差异（12.2对比8.8个月，p=0.40）。综上，我们的研究发现TRIM21可通过调节PD-L1和影响肿瘤微环境中的免疫细胞，增加放疗敏感性，与放疗产生协同抗肿瘤效应。临床样本提示TRIM21可能可以作为潜在的生物标记物预测不可手术的III期NSCLC患者的放疗后的PFS。