放射抗拒性人鼻咽癌肿瘤干细胞的筛选与鉴定及放射耐受机制探讨

肿瘤干细胞的存在被认为是鼻咽癌局部复发及放射治疗失败的关键原因。本研究用免疫磁珠法分离、筛选鉴定人鼻咽癌CNE-2及放射耐受CNE-2R的CD133+细胞，并对其干细胞特性通过裸鼠成瘤实验、电镜超微结构观察及特异性蛋白表达等试验予以验证。在此基础上进一步检测射线照射后的细胞的放射敏感性参数，细胞周期及细胞凋亡的改变，DNA放射性损伤以及DNA损伤信号通路相关通路基因及蛋白的表达，给予关键基因特异性抑制剂逆转干细胞放射抗拒性，探讨鼻咽癌放射抗拒的机制，阐明其分子调控途径和基因表达谱。从而为通过分子干预手段克服鼻咽癌的放射治疗耐受性、增强放射治疗的敏感性、提高疗效及治愈率提供参考依据,并为放射损伤防护的研究提供新的思路。

肿瘤干细胞的存在被认为是鼻咽癌局部复发及放射治疗失败的关键原因。本研究用免疫磁珠筛选人鼻咽癌CNE-2及放射耐受CNE-2R 的CD133+细胞， 分别采用无血清培养法、平板克隆试验及裸鼠体内成瘤检测CNE-2-TSC及CNE-2R-TSC的体外增殖及体内成瘤能力，电镜观察形态学差异。检测2GyX射线照射后的放射敏感性参数，中性彗星分析及γH2AX分析DNA损伤修复状态，采用DNA损伤信号通PCR芯片检测CNE-2-TSC及CNE-2R-TSC差异表达的基因，对部分差异表达的基因进行蛋白表达验证。结果显示CNE-2-TSC及CNE-2R-TSC细胞在无血清培养基中呈悬浮生长，均可以形成肿瘤干细胞球。但CNE-2R-TSC增殖能力强，具有较高的克隆形成能力(P<0.01)及裸鼠成瘤率(P<0.05)。两种移植瘤形态在HE常规染色无明显差异，而透视电镜发现CNE-2R-TSC细胞核大异型，核沟深，核仁也大，细胞器肥大，说明移植瘤细胞的高度恶性。2GY的X线照射后2h开始，CNE-2-TSC及CNE-2R-TSC彗星细胞均出现DNA迁移。但CNE-2R-TSC细胞的头部DNA百分含量减少，尾长、彗星长度、尾部DNA百分含量、TM和OTM增加，且随时间的延长更为明显，说明细胞DNA损伤程度加重；细胞照射 6h，细胞核内即出现明显的绿色荧光，48 h时达峰值。CNE-2R-TSC各时间段细胞γH2AX阳性细胞率明显高于CNE-2-TSC组（P<0.01）。CNE-2-TSC和CNE-2R-TSC细胞有差异表达的DNA损伤修复相关基因41个，其中上调基因27个,下调基因14个。Western blot检测4个差异表达基因(GADD45a、RRAD1、RAD9a及RCF2)的蛋白质表达水平。GADD45a、RRAD1在CNE-2 R -TSC表达水平明显下调，而RAD9a及RCF2明显上调。我们认为X线照射后,鼻咽癌干细胞因具有强于其他肿瘤细胞的放射耐受性而出现选择性存活且细胞比例升高,其生物学特性如细胞存活率、体内致瘤率增加,侵袭性增强。而前期研究建立的放射抗拒性细胞株的具有更强的放射耐受性，其分子机制与放射后增强了肿瘤干/祖细胞的DNA双链损伤修复、DNA切除修复能力，及对人DNA多聚酶的校正、下调一些抑癌基因表达等相关。确切的分子学机制还需要进一步深入研究。