超声激活原卟啉IX诱导人白血病细胞凋亡和细胞自噬性死亡的机制探讨

项目拟在声动力学疗法（SDT）抗癌效应研究基础上，追踪细胞自噬性死亡研究最新进展，采用低强度聚焦超声结合原卟啉IX探讨SDT诱导人白血病细胞的多种死亡模式及其机制。项目拟选用白血病典型细胞系HL-60和K562为研究对象，并通过RNAi技术分别建立对应的凋亡缺陷型和自噬缺陷型细胞模型，通过优化SDT诱导白血病细胞凋亡和自噬性死亡的理化参数组合；分析不同细胞死亡模式在SDT抗肿瘤效应中的协同作用和细胞差异性；探索SDT触发肿瘤细胞凋亡、自噬性死亡的作用靶点、信号通路和基因调控；采用加入细胞自噬和凋亡的特异性药物抑制剂，并结合siRNA技术检测SDT引发不同细胞死亡模式的变化及相互转换，重点探讨细胞凋亡与细胞自噬性死亡的内在联系；阐明SDT引发不同白血病细胞死亡模式的分子生物学机制；为白血病治疗中自体干细胞移植物的体外净化，降低移植后肿瘤的复发率等方面提供更加有效的实验设计方案和临床治疗手段。

通过筛选SDT激活不同白血病细胞凋亡和自噬的最优实验参数组合，比较了不同白血病细胞对SDT应答效应的敏感性差异以及同一种细胞在SDT作用过程中所涉及的不同细胞死亡模式；重点研究了SDT诱导不同白血病自噬的相关理化因子临界阈值、作用靶点、信号转导途径和关键基因调控；采用加入自噬、凋亡特异性抑制剂，并结合RNA干扰技术，探讨了细胞自噬和凋亡在SDT抗肿瘤效应中的主导地位以及二者之间的密切联系及相互作用机制；阐明了不同白血病细胞在SDT作用下所产生的不同细胞死亡模式及相关分子生物学机制。.取得阶段性研究成果如下：.①检测到PpIX在K562、HL-60、U937中含量比PBMC高出约6-18倍，比其它正常组织来源的细胞也高出多倍，显示出PpIX在白血病细胞中特异性富集。利用MTG并结合共聚焦显微镜观察到PpIX在不同白血病细胞中主要定位于线粒体，提示线粒体可能是PpIX-SDT作用的主要靶点。.②超声强度和PpIX浓度的选择对SDT杀伤白血病细胞有着明显的差异，项目筛选出实验用SDT参数（对正常细胞损伤较小而又能有效诱导肿瘤细胞凋亡和自噬）：对于K562和U937细胞，选择1 W/cm2超声和2 μg/ml PpIX，对于HL-60细胞为1 W/cm2超声和0.1 μg/ml PpIX。.③在上述基础上，通过Annexin V/7-AAD双染、WB检测Caspase-3活化等方法证实SDT可诱导K562，HL-60，U937发生不同程度凋亡，线粒体-caspase依赖性凋亡通路在SDT抗肿瘤研究中起重要作用。SDT处理后胞内ROS显著升高，ROS清除剂NAC明显抑制Caspase-3活化和PARP剪切，保护了SDT诱导的细胞存活能力的下降，提示ROS在SDT诱导白血病细胞凋亡过程中起重要作用。.④通过WB检测LC3-II的剪切、eGFP-LC3基因转染、共聚焦显微镜观察LC3和Lamp2共定位等实验证实在所选定条件下SDT可诱导细胞自噬发生。.⑤通过自噬抑制剂3-MA/ Bafilomycin A1、凋亡抑制剂z-VAD-FMK及siRNA干扰自噬/凋亡关键基因等研究了SDT诱导肿瘤细胞自噬和凋亡间的关系，发现SDT诱导白血病细胞凋亡和自噬的发生呈时间依赖性。K562细胞中，自噬潮出现凋亡之前，用自噬特异性药物抑制剂可抑制自噬体的形成，增强SDT诱导的细胞凋亡