毛乳头细胞中GRG5对TCF4调控机制的研究

Hair dermal papilla cells located at the bottom of hair follicles play pivotal roles in hair formation, growth and cycling. The biological dysfunction of hair dermal papilla cells is the main factor that cause disequilibrium of hair follicular cycles and alopecia. In past research，we have found TCF4 gene which plays a crucial role in nuclear differentially expressed in hair dermal papilla cells, and we have also proved that GRG5 was its interaction partners. The aim of this study is to elucidate the biological fuction of GRG5 regulates TCF4 in dermal papilla cells. In this study, we will apply to influent the expressions the GRG5 in dermal papilla cells, then obserbe the biological functions of dermal papilla cells in vitro and induce the rebuilding of it in vivo by TOPFLASH reporter, co-Immunoprecipitation, immunofluorescence, QRT-PCR and Western blotting. So we can clarify the functioncal mechanism of GRG5 regulating TCF4 to futher study of wnt signaling pathway in regulating the biological function of dermal papilla cells. The study also could provide a new way for the researches for hair follicle biology and a new vision for the treatment for clinical diseases.

毛乳头细胞在毛囊的生长发育和周期性再生中起主导作用，其生物学功能的异常改变是导致毛囊周期失衡和脱发性疾病的起始因素。Wnt信号通路是调控毛乳头细胞凝集性生长功能特性的重要通路，但其机制尚不清楚。申请者前期研究发现，T细胞因子4作为Wnt信号通路关键信号分子在毛乳头细胞的生物学功能调控中起重要作用，而Groucho相关基因5可能通过与TCF4结合抑制这种作用。本课题拟采用基因转染、CRISPR/Cas技术干预GRG5在毛乳头细胞中的表达，通过双荧光素酶、免疫共沉淀、免疫荧光染色、QRT-PCR、Western blotting等技术，在体外培养观察毛乳头细胞生物学功能及在裸鼠体内诱导毛囊重建，从而明确GRG5调控TCF4的具体作用机制，为深入研究Wnt信号通路在调控毛乳头细胞生物学功能中的作用奠定基础，也为研究毛囊生物学和毛发疾病的致病机制提供了新的思路。

本科室早期课题采用抑制性消减杂交方法首次发现Wnt信号通路关键信号分子T细胞因子4（T cell factor4，TCF4）基因在不同时期的人毛囊毛乳头细胞中呈差异表达，特别是在生长期毛乳头细胞中上调表达，表明其对毛乳头细胞生物学功能的调控起重要作用。前期课题通过构建凝集性生长毛乳头细胞酵母双杂交文库，以TCF4 N端和DNA结合域为诱饵蛋白，筛选出与TCF4相互作用的蛋白GRG5，提示其在对TCF4下游基因的转录和表达调控中有可能具有重要作用。在此基础上，本课题成功构建pIRES2-TCF4和pIRES2-GRG5质粒，以GRG5作为捕获抗体，捕获裂解DPC后的免疫沉淀物并进行免疫印迹检测，证实在凝集生长的毛乳头细胞中TCF4与GRG5存在相互作用。并通过免疫共沉淀、基因转染、CRISPR/Cas、RT-PCR、Western blotting、荧光素酶活性分析、DPC增殖、细胞因子分泌等技术，首次发现GRG5过表达后对TCF4介导的Wnt信号通路活性及毛乳头细胞的生物学功能具有抑制作用。设计靶向GRG5基因的gRNA，利用CRISPR/CAS9技术完成GRG5基因敲除并转染毛乳头细胞，发现GRG5敲除可解除对TCF4介导的Wnt信号通路活性及毛乳头细胞的生物学功能的抑制作用。这将有助于进一步阐明 TCF4 介导的Wnt信号通路在毛乳头细胞生物学功能调控中的分子机制，为深入其在毛囊发育和毛囊周期性再生调控中的作用奠定基础，也可为毛囊生物学和毛发疾病的致病机制提供新的思路。