TCF4调控毛乳头细胞凝集生长相互作用蛋白及功能研究

毛乳头细胞在毛囊发育和周期性再生调控中起主导作用，其生物学功能异常变化是导致毛囊周期失衡和脱发性疾病的主要起始因素。申请者采用抑制性消减杂交方法首次发现TCF4基因在人毛囊毛乳头细胞中呈差异表达，经基因转染及RNA干扰技术研究表明TCF4可能在毛乳头细胞生物学功能调控中起重要作用。本课题拟构建凝集生长毛乳头细胞酵母双杂交文库， 以TCF4 N 端和DNA 结合域为诱饵蛋白，筛选凝集生长毛乳头细胞中与TCF4相互作用的蛋白，确定捕获蛋白与TCF4间的作用区域及对TCF4的调控作用，这将有助于阐明TCF4基因在毛乳头细胞生物学功能调控中的具体分子机制，为深入研究该基因在毛囊发育和毛囊周期性再生调控中的作用奠定基础，也可为毛囊生物学和毛发疾病的研究提供新的思路。

我们提取毛乳头细胞，并培育凝集生长状态的毛乳头细胞。将凝集生长毛乳头细胞mRNA提取并逆转录合成cDNA,定向克隆于穿梭载体中，凝集生长毛乳头细胞酵母双杂交文库的构建扩增。通过构建真核表达载体pIRES2-MAD2B和pIRES2-TCF4质粒，在脂质体2000的介导下转染毛乳头细胞，绿色荧光显微镜下观察转染效率，使用Wesrern blot检测目的蛋白的表达，并验证两种蛋白的相互作用，比较细胞增殖状况、Wnt通路信号强度、毛乳头分泌胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth-promoting factors，HGF）变化情况。结果为MAD2B和TCF4基因成功过表达于毛乳头细胞。免疫共沉淀实验提示两种蛋白在毛乳头中存在相互作用。在MAD2B过表达组的毛乳头细胞中，Wnt途径信号通路强度下调，与对照组和TCF4阳性组对比有统计学意义（p＜0.05）；CCK-8实验提示细胞增殖活性下降，与空白组比较差异有统计学意义；IGF-1、VEGF、HGF的mRNA表达有所下降。课题研究结果：免疫共沉淀提示MAD2B与TCF4在毛乳头细胞中存在相互作用，MAD2B过表达后对毛乳头细胞增殖及Wnt信号通路有抑制作用，并可能对毛乳头细胞的旁分泌因子IGF-1、VEGF、HGF有抑制作用。