一种新型筛选HCV NS3/4A 蛋白酶抑制剂的细胞系统的建立及评价

丙型肝炎病毒（HCV）NS3/4A蛋白酶是抗HCV的主要靶标。缺乏可靠的HCV细胞培养模型, 限制了NS3/4A蛋白酶抑制剂的筛选。本项目依据NS3/4A蛋白酶的催化特性和细胞凋亡酶-3（Casp3）的活化过程，建立Tet-off和NS3/4A蛋白酶双稳定的HepG2细胞系，该细胞系在dox诱导下调控表达具有酶活性的NS3/4A蛋白；利用重叠PCR 改构Casp3基因，构建其原核表达载体，表达并纯化PTD-rCasp3融合蛋白作为底物；运用流式细胞术、TUNEL等证实PTD-rCasp3可以进入上述细胞，其活化依赖于NS3/4A蛋白酶的水解，并介导细胞凋亡；以其候选抑制剂降低细胞凋亡程度等为指标，用细胞凋亡酶活性测定和MTT法建立细胞内NS3/4A蛋白酶活性测定系统，并用商品化的抑制剂对其进行初步评价。本研究的完成将为筛选NS3/4A蛋白酶药物提供技术平台，这对于防治HCV具有重要意义。