泛素结合酶UBE2O介导c-Maf蛋白泛素化的分子机制及其在多发性骨髓瘤中的意义

c-Maf is an important nuclear transcription factor and is frequently overexpressed in multiple myeloma (MM). c-Maf is found closely associated with pathophysiology of MM and poor prognosis. It is reported that c-Maf could be ubiquitinated and degraded in the proteasomes. Protein ubiquitination is process involved in multiple enzymes, including ubiquitin activating enzymes (E1), ubiquitin conjugating enzymes (E2) and ubiquitin ligases (E3). However, it is not known yet about the ubiquitinaiton enzymes for c-Maf. We recently found that the ubiquitin conjugating enzyme UBE2O can bind to c-Maf and mediates its poly-ubiquitination, but the detailed mechanisms are not clear. In this proposal, we will investigate how UBE2O mediates c-Maf ubiquitination. We will demonstrate the function of UBE2O in c-Maf ubiquitination with the ubiquitin conjugation reaction system. We will also make a serial of UBE2O truncates containing various functional domains and evaluate their action in c-Maf ubiquitination. Since c-Maf is critical in MM, whether UBE2O also plays an important role in MM is not known. Therefore, we will subsequently introduce lentivirus mediated UBE2O into MM cells to evaluate how UBE2O affects MM cell proliferation, apoptosis and tumorigenesis in nude mice. This proposal will provide more details in c-Maf ubiquitination, UBE2O function and extend to understanding in MM pathophysiology.

c-Maf是重要的核转录因子，在多发性骨髓瘤（MM）中常见高表达，并与MM的发生和不良预后密切相关。我们前期的研究发现c-Maf可发生多聚泛素化并经蛋白酶体降解，因此寻找c-Maf的特异性泛素化酶对于MM的治疗具有重要意义。目前尚不清楚c-Maf的泛素化酶有哪些，我们发现UBE2O可与c-Maf结合并介导其发生多聚泛素化。为进一步探讨其具体的作用机制，本项目将研究UBE2O对c-Maf进行泛素化修饰的特征及位点；分析UBE2O各结构域的功能及其介导c-Maf泛素化的具体机制；研究UBE2O对c-Maf下游靶基因转录及表达水平的影响；构建UBE2O的慢病毒表达系统分析其对MM细胞增殖、凋亡、成瘤性的影响。本项目将有助于深入理解c-Maf的泛素化降解机制、UBE2O的功能及其与MM发生发展的关系，为MM的治疗提供新的理论依据。

本项目通过亲和纯化/串联质谱分析和免疫共沉淀分析，发现UBE2O与多发性骨髓瘤（MM）细胞中的关键转录因子c-Maf具有相互作用。UBE2O是一个E2泛素结合酶，但是也具有一定的E3活性，我们的研究结果发现UBE2O可介导c-Maf的多聚泛素化降解，并下调了c-Maf的转录活性和其下游蛋白细胞周期蛋白D2的表达。DNA微阵列显示UBE2O在正常骨髓细胞中高表达，但在MM细胞中表达下调。当UBE2O表达增多时，MM细胞中的c-Maf蛋白显著降低，MM细胞发生凋亡。进一步的研究发现UBE2O仅能促进c-maf的泛素化降解，对大Maf家族的其他成员mafA、mafB无影响，说明其对c-maf的调控作用具有一定的特异性。UBE2O介导c-maf泛素化的关键活性位点是K331、K345。而UBE2O则发挥了E3的作用，利用Ub各赖氨酸位点的突变质粒发现UBE2O所作用的是Ub的48-位点。裸鼠中的MM细胞移植瘤显示UBE2O的过表达拮抗了裸鼠中骨髓瘤异种移植物的生长，这与c-Maf下调和激活凋亡途径有关。本项目在研究过程中，还发现UBE2O可抑制Beclin1发生K63位点的泛素化，而Beclin1是一个重要的自噬相关蛋白，经过饥饿处理后，细胞中Beclin1的泛素化水平增加，而转染UBE2O后，Beclin1的泛素化水平则显著降低，表明UBE2O可通过Beclin1参与自噬的调控。此外，去泛素化酶USP5、USP7也都可影响c-maf的泛素化调控，USP5、USP7均能抑制MafA、mafB、c-maf蛋白发生多聚泛素化，从而稳定了Maf的蛋白质水平，siRNA干扰USP7的表达后，Maf蛋白的水平也显著降低。上述这些研究结果，为理解多发性骨髓瘤的病理学基础、UBE2O以及c-maf的生物学功能提供了新的视角。