三维灌注培养miRNA/Smad调控SMSCs软骨分化维持表型稳定的研究

Mesenchymal stem cells (MSCs) are being recognized as a viable cell source for tissue-engineered cartilage. However, a yet-unsolved problem is the unwanted up-regulation of markers of hypertrophy, such as alkaline phosphatase (AP) and type X collagen, during in vitro chondrogenesis，instead of stable articular cartilage-like tissue. Previous study in our group indicated that at the MSC differentiation later stage, the express level of PTHrP is decreased and the express level of Smad1/5/8 phosphorylation is increased. We postulate that Smad1/5/8 phosphorylation and PTHrP factor are associated with terminal differentiation and mineralization. In this study, we seek after microRNA related Smad pathway and PTHrP factor and the effects of ?uid shear stress on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells through miRNA/Smad pathway. This will help us better understand the regulatory mechanism of MSCs proliferation and differentiation process, and will lay at theoretical foundation for the future use of MSCs to construct tissue engineered cartilage.

间充质干细胞（MSC）是目前构建组织工程化人工软骨重要的细胞来源，然而，利用MSC在体外诱导软骨分化过程中容易发生软骨细胞终末分化以及钙化，从而不能构建表型稳定的组织工程化透明软骨。我们在前期工作发现：MSC诱导软骨分化与正常关节透明软骨细胞相比，其甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）在分化后期分泌表达减少并且Smad1/5/8信号磷酸化表达增加，推测其可能与软骨的终末分化有关，但具体调控机制尚不清楚。本研究模拟软骨细胞外基质成分，构建胶原-硫酸软骨素-透明质酸三维软骨细胞体外培养体系，在此三维培养体系上，研究调控滑膜源性间充质干细胞(SMSCs)软骨终末分化的Smad1/5/8信号通路及PTHrp分泌的miRNAs，并进一步研究三维灌注培养系统中流体剪切力对 miRNAs/Smad途径的作用。为探索影响MSC软骨终末分化的因素，明确其调控机制，构建表型稳定的组织工程化透明软骨奠定基础。

间充质干细胞（MSC）是目前构建组织工程化人工软骨重要的细胞来源，然而，利用MSC在体外诱导软骨分化过程中容易发生软骨细胞终末分化以及钙化，从而不能构建表型稳定的组织工程化透明软骨。为探索影响MSC软骨终末分化的因素，明确其调控机制，本研究开展了以下实验：（1）模拟软骨体内微环境，建立适合间充质干细胞软骨分化的体外三维培养体系，在此培养体系中，研究与TGF-β3诱导的间充质干细胞（MSCs）软骨终末分化相关的关键的Smad信号通路；（2）探讨在MSCs软骨分化中,作用于Smad信号通路调控软骨细胞终末分化的有关的miRNA。通过这项研究，我们模拟软骨体内的细胞基质成分，用冷冻干燥技术制备了可用于在体外研究MSCs分化的胶原-透明质酸-硫酸软骨素三维培养体系。进一步明确了在生长因子TGF-β3诱导MSCs向软骨分化过程中，与软骨细胞终末分化有关的TGF-β/Smad1/5/8信号通路,发现了关键的调节因子（Tgfbr3）；初步证实了PTrhP通过Smad1/5/8信号通路防止终末分化；发现了作用于Smad信号通路调控软骨细胞终末分化有关的miRNA(miRNA23a,miRNA21,miRNA200b-3p)。为探索影响MSC软骨终末分化的调控机制，构建表型稳定的组织工程透明软骨奠定了基础。